浅谈导致ELISA测定异常结果的原因与对策.docx

    浅谈导致ELISA测定异常结果的原因与对策    胡爱明1，朱淑琴1，刘红道1，鄢涛1，龙必美2 （1.吉安市畜牧兽医局，江西 吉安 343000；2.吉安市吉州区曲濑畜牧兽医站）酶联免疫吸附试验（ELISA）技术自1971年问世以来，因其具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于兽医临床检验中近几年，随着动物疫病形势复杂化，畜产品质量安全意识与日俱增，ELISA测定[]被主要应用于大量的血清、尿、饲料等样品筛检中但在实际ELISA测定操作中，影响ELISA测定结果准确的因素较多，导致出现白板、花板、弱板等不正常现象和假阳性、假阴性等异常结果笔者对ELISA测定过程中出现一些问题进行分析和总结，浅谈一些个人看法，以期给同行带来一些启发，提高ELISA的测定质量1 样品处理不严格ELISA测定结果的判定是通过辣根过氧化物酶（HRP）与特异性结合产生的抗原-抗体复合物相互作用后显色与否来实现的对样品进行筛选或处理能降低试验中因样品因素导致假阳性和假阴性等异常测定结果的可能性如溶血和被细菌污染的样品大大提高样品中辣根过氧化物酶（HRP）或类似过氧化酶活性物质的浓度，从而使ELISA出现显色反应，导致假阳性的出现；在冰箱中保存过久的样品由于IgG抗体聚合成多聚体，导致使用间接法测定的ELISA试验中本底过深，出现假阳性。

反复冻融会使样品效价降低，导致假阴性出现一般来说，在冰箱4℃~8℃冷藏保存的[来自wwW.lw5u.Com]样品需一周内测定，一周以后测定的-20℃保存，长期保存需多次测定的样品要少量分装冰冻保存2 试剂准备不到位选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、操作方便省时、正规厂家的试剂同时，切忌混用同厂家生产的不同批号的试剂，检测时尽量不用临近有效期的试剂另外，试剂在使用前应平衡至室温（约25℃），这是确保不出现异常测定结果的关键做法一般室温放置20~30 min，冬季室温过低，可将试剂放置于37℃恒温箱10 min以上，这样可以避免ELISA试验反应不充分、弱阳性样品检测假阴性结果等现象的发生此外，稀释试剂的水，必须使用重蒸水或去离子水，其他水因杂质过多或有酸碱度都会影响检测结果的准确性3 样品稀释不精准所有的ELISA检测试剂盒，均要求将样品稀释至适当的倍数，以降低非特异反应的概率一般来说，每个试剂盒对样品的稀释倍数均有严格的规定，其确定的稀释倍数是通过大量试验确定的，以保证试验的灵敏度和特异性但是，有些操作者未能理解其意义，没有严格按照说明书操作，尤其是小剂量移取时，一旦不够精准，造成样品稀释倍数相差甚远，那么一定会导致检测结果出现严重偏差。

4 加样操作不规范首先加样不可太快，否则无法保证微量移液器加样剂量的准确性和均一性其次要避免将液体加在反应孔壁上部，因为每孔上部成为反应板中各孔的非被包被的机率非常大，尤其工厂化生厂的包被板，可能会导致非特异性吸咐此外，要做到一份样品一个移液头，以防交叉污染5 温育环节太随意温育是ELISA测定中的一个关键环节，只有在一定适宜的温度和与之相对应的特定时间，液相中的抗原（抗体）才能与固相载体上的特异抗体（抗原）充分结合每个试剂盒都有明确的温育温度和时间，最常用的温育温度有37℃或室温，少部分是2℃~8℃，因为不同试剂盒有不同的温育时间和温度的要求，如果都用同一温育时间和温度，那必然导致测定结果出现偏差6 洗板操作不彻底洗板是ELISA测定中极为关键的一环节，它将温育过程中液相非特异性成分与反应板中固相载体的抗原（抗体）结合产生的抗原抗体清除出去，从而进一步保证ELISA测定的特异性同样，每个试剂盒对洗板的次数和浸泡时间都有明确规定，绝不能擅自更改此外还须注意，洗板时不要让洗液溢出，每次甩板拍干后的吸水纸一定要更换，尤其是拍过酶标记物的吸水纸，否则影响试验结果7 显色时间把关不严一般来说，显色时间过短，结果偏低，显色时间过长， 对照值偏高或非特异性显色概率增加，因此显色一定要控制好时间。

可根据说明书进行操作此外不同的试剂盒对酶联仪的波长有明确要求，通常为630 nm和450 nm，只要上机时稍加注意即可避免总之，只要操作者按照说明书要求操作，做到专心细致，精益求精，就一定能大大降低非正常结果出现的概率，确保ELISA测定的精准，提高ELISA试剂盒的实用性，充分体现ELISA试验的优越性收稿日期：2012-03-16）  -全文完-。