Marfey法与质谱联用技术.ppt

Marfey法与质谱联法与质谱联用技术及其应用用技术及其应用 目目 录录前言前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理决定氨基酸绝对构型的原理 1. Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨 2. Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用 3. 衍生化过程衍生化过程小小 结结应应 用用 举举 例例前前 言言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：种：（（1）化学转变法；）化学转变法；（（2）旋光比较法；）旋光比较法；（（3）旋光谱（）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（）和圆二色光谱（CD）；）；（（4）单晶）单晶X－射线衍射法；－射线衍射法；（（5）核磁共振法；）核磁共振法；（（6）） Marfey法与质谱联用法与质谱联用 目前酶法和目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法，构型，但这些都是直接的方法， 确定一种对映确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。

因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来 另一方面，色谱方法例如另一方面，色谱方法例如GC和和HPLC已经已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸色谱学方法的缺可以同时分析十种以上氨基酸色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的酸的肽类是不适用的 1984年，年，Marfey发明了一种用发明了一种用HPLC来决定氨基来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将通过手性试剂进行衍生化，将D-和和L-氨基酸用氨基酸用HPLC分离成对映异构体分离成对映异构体于是引入手性试剂于是引入手性试剂FDAA（（（（1-氟氟-2，，4-二硝基二硝基苯基苯基-5））-L-丙氨酰胺，丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide ），被命名为），被命名为Marfey试剂。

试剂氨基酸与氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在进行分离，并在UV340 nm处进行检测处进行检测L-氨基酸衍生物常常先于对应的氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度的灵敏度因此，因此， Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用证，证实肽类合成中的外消旋作用但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的常见的Marfey试剂如下所示： L-FDAA: (1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺 L-FDVA: ……………..……………..-L-缬氨酰胺 L- FDPA: ……………..……………..-L-苯丙氨酰胺 L- FDIA: ……………..……………..-L-异亮氨酰胺 L- FDLA: ……………..……………..-L-亮氨酰胺 D-FDAA: ……………..……………..-D-丙氨酰胺其结构如下： 为了将为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：来，必须解决如下三个问题：（（1）解释）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，法用作色谱技术的分离机制，及其局限。

及其局限2）如何在没有标准品的情况下有效地将）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸3）如何从一个肽类样品的）如何从一个肽类样品的L-或或D-氨基酸中获氨基酸中获得相应的对映异构体得相应的对映异构体LC/MS 决决 定定 氨氨 基基 酸酸绝绝 对对 构构 型型 的的 原原 理理Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用衍生化过程衍生化过程Marfey 法分离机制的探讨法分离机制的探讨下图是用下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作过程，命名作“高级高级Marfey法法”如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部如图所示，肽水解所得氨基酸的混合物分成两部分（分（sample 1和和sample 2)Sample 1与与FDAA衍生化后，直接用衍生化后，直接用LC/MS分分析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何析，通过衍生物的保留时间和质谱得以确定为何种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面种氨基酸，如果检测到有非常见氨基酸，其平面结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明。

结构可以通过其衍生物的质谱得以阐明Sample 2主要用来决定非常见氨基酸的绝对构主要用来决定非常见氨基酸的绝对构型由于天然存在的肽类往往由型由于天然存在的肽类往往由D-型或型或L-型氨基型氨基酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，酸组成，在色谱图上，每个氨基酸给出一个峰，其绝对构型无法在这一步决定因此，为了得到其绝对构型无法在这一步决定因此，为了得到其对映体，其对映体， Sample 2中的氨基酸必须在适当的中的氨基酸必须在适当的条件下进行外消旋化但是，与条件下进行外消旋化但是，与FDAA衍生化及衍生化及外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现外消旋化后所得的色谱图变得复杂了，很难发现一对差向异构体一对差向异构体在该法中使用了质量色谱每对差向异构体有在该法中使用了质量色谱每对差向异构体有两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片两个峰，在以目标氨基酸衍生物分子离子碎片的的m/z值为检测指标的质量色谱图上可以选择值为检测指标的质量色谱图上可以选择到这两个峰到这两个峰然后，通过比较然后，通过比较Sample 1中原峰的保留时间和中原峰的保留时间和Sample 2中新产生峰的保留时间，就可以根据中新产生峰的保留时间，就可以根据Marfey法中的洗脱规律来判定绝对构型了。

法中的洗脱规律来判定绝对构型了本法将可购得的氨基酸分为四类：中性本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为分离行为 FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括酚羟基、巯基包括N-甲基反应甲基反应每种氨基酸的非对映每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其异构体对都是通过其D-异构体的保留时间异构体的保留时间(tRD)和和L-异构体的保异构体的保留时间留时间(tRL)的差值的差值(△ △t)来判定的当来判定的当△△t值大于值大于±1.0时，每组时，每组非对映异构体对完全非对映异构体对完全被分离为两个非对映被分离为两个非对映异构体左边的表格显示了四左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异体保留时间及其差异对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非型非对映异构体都先于对映异构体都先于D-型被洗脱下来随着烃基侧型被洗脱下来随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。

酪氨酸得到两衍生物，氨基酸和脯氨酸除外）酪氨酸得到两衍生物，因为因为FDAA会引入到－会引入到－NH2上，也会引入到酚－上，也会引入到酚－OH上酸性或含－酸性或含－OH氨基酸的判定相对于中性氨基氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些因为其保留时间变短侧链含有酸要难一些因为其保留时间变短侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定在含－氨酸更难判定在含－OH的氨基酸中，丝氨的氨基酸中，丝氨酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似的判定能力另外，的判定能力另外，β-OH天冬氨酸的两个非天冬氨酸的两个非对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的对映异构体显示相反的洗脱规律，而且它们的保留时间极短保留时间极短对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生对于碱性氨基酸，赖氨酸和鸟氨酸有三种衍生物：单物：单α-取代、单取代、单ω-取代和二取代衍生物；取代和二取代衍生物；组氨酸有两种衍生物，单组氨酸有两种衍生物，单α-取代和双取代衍生取代和双取代衍生物。

它们的单物它们的单α-取代和双取代可被判定，而单取代和双取代可被判定，而单ω-取代衍生物无法判定，表明取代衍生物无法判定，表明α-氨基的衍生氨基的衍生化对于判定是必要的化对于判定是必要的但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相但是碱性氨基酸的洗脱规律取决于所选流动相的的PH大小，可能为大小，可能为L D的常规顺序，也可的常规顺序，也可能相反赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正能相反赖氨酸和组氨酸的双衍生物显示了正常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，常的洗脱规律，而鸟氨酸却显示相反的顺序，尽管它们有较长的保留时间尽管它们有较长的保留时间购得的购得的N-甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、甲基氨基酸，例如丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的缬氨酸、亮氨酸和天冬氨酸的N-甲基衍生物，甲基衍生物，尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能尽管其保留时间长于各母氨基酸，但其判定能力要低于母氨基酸尤其是力要低于母氨基酸尤其是N-甲基丙氨酸无法甲基丙氨酸无法判定，判定， N-甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出甲基天冬氨酸以相反顺序被洗脱出综上，综上，FDAA的的L-氨基酸衍生物并不总是氨基酸衍生物并不总是先于对应的先于对应的D-氨基酸衍生物被洗脱下来。

氨基酸衍生物被洗脱下来因此，阐明不了分离机制，因此，阐明不了分离机制， Marfey 法就法就不能用于非常见氨基酸的判定不能用于非常见氨基酸的判定此外，实验结果表明以下两点对于洗脱此外，实验结果表明以下两点对于洗脱顺序至关重要：顺序至关重要：①①氨基酸的疏水性；氨基酸的疏水性；②②在分离过程中在分离过程中FDAA衍生物的构象衍生物的构象使用使用UV（二极管阵列检测器）和（二极管阵列检测器）和NMR方法来方法来解决该问题（因为，它们易受构象的影响）解决该问题（因为，它们易受构象的影响）如上图所示，在如上图所示，在340和和414nm处有特征性最大处有特征性最大吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及吸收，是由二硝基苯上的硝基与氨基酸及L-丙氨酰胺的－丙氨酰胺的－NH2之间的氢键所形成的发色团之间的氢键所形成的发色团产生的；而且，产生的；而且，D-缬氨酸衍生物的缬氨酸衍生物的UV谱与其谱与其L-型衍生物的相符所有被测氨基酸的衍生型衍生物的相符所有被测氨基酸的衍生物显示非常相似的物显示非常相似的UV谱，脯氨酸和谱，脯氨酸和N-甲基氨甲基氨基酸除外尤其是给出相反洗脱顺序的双取基酸除外尤其是给出相反洗脱顺序的双取代衍生物及代衍生物及D-和和L-鸟氨酸显示了特征的鸟氨酸显示了特征的UV谱，谱，其吸收波长从其吸收波长从340nm蓝移到蓝移到320nm。

这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢这些结果表明，稳定的构象，包括分子内氢键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面键，形成了一个像蒽一样的三环系统的平面分子（如下图所示）分子（如下图所示）综上，对于综上，对于L-和和D-氨基酸衍生物的判定基于其氨基酸衍生物的判定基于其疏水性的差异，源于氨基酸和疏水性的差异，源于氨基酸和L-丙氨酰胺丙氨酰胺α－－碳上两个疏水性取代基的顺／反位置于是，碳上两个疏水性取代基的顺／反位置于是，顺式排列的顺式排列的FDAA衍生物与衍生物与ODS作用更强烈，作用更强烈，比反式排列的衍生物有更长的保留时间比反式排列的衍生物有更长的保留时间对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代对于大多数氨基酸来说，由于氨基酸侧链取代基的疏水性往往小于－基的疏水性往往小于－COOH，， D-氨基酸衍生氨基酸衍生物具有顺式结构，因此在物具有顺式结构，因此在Marfey 法中法中L-氨基酸氨基酸衍生物往往先于衍生物往往先于D-氨基酸衍生物出柱氨基酸衍生物出柱另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是另有文献证明，氢键的形成对结构的判定也是很有用的很有用的L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物的衍生物的NOE实验显示，缬实验显示，缬氨酸的氨酸的α-质子及质子及L-丙氨酰胺的丙氨酰胺的α-质子与苯环的质子与苯环的H－－6之间存在着强烈的之间存在着强烈的NOE，如上图所示；，如上图所示；而而H－－6与缬氨酸的异丙基和与缬氨酸的异丙基和L-丙氨酰胺的甲基丙氨酰胺的甲基之间没有之间没有NOE。

另外，另外，D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生衍生物与物与L-衍生物几乎显示相同的衍生物几乎显示相同的NMR行为这些行为这些结果表明，两结果表明，两α-质子都在空间上位于苯环质子都在空间上位于苯环H－－6的附近，在的附近，在L-和和D-缬氨酸衍生物中均如此缬氨酸衍生物中均如此由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除－由此，缬氨酸和丙氨酰胺的除－NH2以外的其以外的其它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，它取代基均位于垂直于二硝基苯平面的位置上，在溶液中是稳定的，也是占优势的在溶液中是稳定的，也是占优势的如图所示：如图所示：D-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为顺衍生物为顺（（Z）－式排列，两个疏水性取代基在同侧；）－式排列，两个疏水性取代基在同侧；L-缬氨酸的缬氨酸的FDAA衍生物为反（衍生物为反（E）－式排列，）－式排列，两个疏水性基团在异侧两个疏水性基团在异侧为了确定为了确定α－－COOH是否对结构的判定必不可少，是否对结构的判定必不可少，文章对氨基酸甲酯和脱－文章对氨基酸甲酯和脱－COOH的氨基化合物的氨基化合物的的FDAA衍生物进行了研究衍生物进行了研究所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上所测氨基酸甲酯及氨基化合物的判定结果如上表所示，它们的表所示，它们的UV谱与母氨基酸的完全相同，谱与母氨基酸的完全相同，保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能保留时间比母氨基酸长，氨基酸甲酯的判定能力下降。

力下降另外，丙氨酸甲酯的另外，丙氨酸甲酯的FDAA衍生物未得判定，衍生物未得判定，丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序丝氨酸甲酯衍生物显示相反的洗脱顺序氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基化合物的保留时间和判定能力几乎与其母氨基酸相同氨基酸相同结果表明，结果表明， α－－COOH对于氨基酸的判定并不对于氨基酸的判定并不总是必须的前已述，与中性氨基酸相比，酸总是必须的前已述，与中性氨基酸相比，酸性和含－性和含－OH氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力氨基酸及氨基酸甲酯的判定能力差，尤其是差，尤其是β-OH天冬氨酸、丝氨酸甲酯天冬氨酸、丝氨酸甲酯,给出给出了相反的洗脱顺序（了相反的洗脱顺序（D L）这些数据进一）这些数据进一步证实一个氨基酸的步证实一个氨基酸的FDAA衍生物在氨基酸和衍生物在氨基酸和L-丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代丙氨酰胺部分有两个处于反式的疏水性取代基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反基，要比其相应的顺式氨基酸衍生物先流出反相柱以上结果也可如下证实，考察用以上结果也可如下证实，考察用FDPA、、FDVA、、FDIA、、FDLA和和D-FDAA的氨基酸衍的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示：生物的分离行为，如下表所示：如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而增长，判定能力也增强；而D-FDAA的氨基酸的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。

衍生物则显示了相反的洗脱顺序本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序因衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序因为在氨基酸中为在氨基酸中α－－COOH是一个常见的功能基是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的团，而一个氨基酸的FDAA衍生物的疏水性也衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，决定于该氨基酸的侧链，因此，DL-氨基酸的氨基酸的tR和洗脱顺序间的关系已如和洗脱顺序间的关系已如Table1所示如如Figure4所示，具有常规洗脱顺序（所示，具有常规洗脱顺序（L D）的）的D-和和L-氨基酸衍生物的氨基酸衍生物的tR要比侧链疏水要比侧链疏水性与性与α－－COOH相当的氨基酸衍生物的长，例相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸如丝氨酸和天冬氨酸另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间物具有相对较短的平均保留时间于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用L-和和D-氨氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。

基酸衍生物的平均保留时间进行解释DL-丝丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（它们有相对较长的保留时间（27.3min），如），如Figure4所示对这种分离行为的研究正在进所示对这种分离行为的研究正在进行之中至此，第一个问题已基本得到解决至此，第一个问题已基本得到解决由于氨基酸与由于氨基酸与L-FDAA所得衍生物的热不稳定所得衍生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对性和低疏水性，致使它们对LC/MS分析的敏分析的敏感性很差于是，选择电喷雾离子化和感性很差于是，选择电喷雾离子化和frit-FAB作为接口，并发展用作为接口，并发展用 (1-氟氟-2，，4-二硝基二硝基苯基苯基-5)-L-亮氨酰胺，即亮氨酰胺，即L-FDLA取代取代FDAA: (1-氟氟-2，，4-二硝基苯基二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺，作为丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将衍生化试剂，以便将Marfey法和质谱联系起法和质谱联系起来。

来Marfey法与质谱的联用法与质谱的联用在在Marfey法中，氨基酸的法中，氨基酸的L-FDAA衍生物由常衍生物由常规的反相规的反相HPLC分离并在分离并在UV340nm处检测；在处检测；在本法中，本法中，UV检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经生物经LC/MS分析为了顺利地将传统的为了顺利地将传统的HPLC条件改为适合条件改为适合LC/MS分析的分析的LC条件，必须解决如下两个问题：条件，必须解决如下两个问题：（1）将从将从HPLC洗脱出来的液体注入质谱仪时，洗脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为其体积应大大减小，因为ESI和和frit-FAB是最终是最终被作为一种接口来使用的被作为一种接口来使用的2）HPLC流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替性缓冲液代替解决方法：解决方法：（（1）应用半微量柱（）应用半微量柱（150×2.1mm I.d,），本法），本法用该柱给予用该柱给予L-和和D-氨基酸衍生物以足够的分离氨基酸衍生物以足够的分离度若为frit-FAB LC/MS 溶液流速应进一步减溶液流速应进一步减小至小至5μl/min。

2）使用使用TFA或醋酸铵缓冲液（或醋酸铵缓冲液（PH＝＝3）作为流）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度尝试了尝试了4种用于分析氨基酸种用于分析氨基酸L-FDAA衍生物的衍生物的LC/MS接口，即接口，即ESI、大气压化学离子化、大气压化学离子化（（APCI）、）、TSP、和、和frit-FAB极性氨基酸衍极性氨基酸衍生物不能用生物不能用TSP和和APCI作为接口作为接口尽管任何氨基酸都可以用尽管任何氨基酸都可以用ESI和和frit-FAB接口，接口，但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的的L-FDAA衍生物的热不稳定性和低疏水性造衍生物的热不稳定性和低疏水性造成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试剂此外，剂此外， ESI和和frit-FAB被选作接口，还因被选作接口，还因为使用这种接口可以抑制温度诱导效应为使用这种接口可以抑制温度诱导效应在在FAB-MS中，疏水性越强的化合物其分离效中，疏水性越强的化合物其分离效果越好衍生化过程衍生化过程引入了一个外消旋化程序，使用引入了一个外消旋化程序，使用DL-FDLA代替代替传统的化学外消旋化，以得到传统的化学外消旋化，以得到L-或或D-氨基酸相氨基酸相应的对映异构体。

应的对映异构体为了获得满足以下条件的衍生化试剂：为了获得满足以下条件的衍生化试剂： （（1）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物；）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物； （（2）不减少以前）不减少以前L-FDAA衍生物的特征衍生物的特征UV吸收；吸收； （（3）符合通常所言的分离机制符合通常所言的分离机制 ］尝试了尝试了4种衍生化试剂种衍生化试剂L-FDVA、、L-FDPA、、L-FDIA和和L-FDLA，具体数据如，具体数据如Table1所示：所示：（（1）被测衍生化试剂的保留时间要比）被测衍生化试剂的保留时间要比L-FDAA长；长；（（2）） L-FDLA ［［M+H］］+的离子丰度最高，约为的离子丰度最高，约为L-FDAA的的30倍由由 Table2可知，可知，L-FDLA的分离效果的分离效果要强于要强于L-FDAA由由Table1、、Table2得，得，L- FDLA是用是用于于LC/MS分析的最分析的最有效的衍生化试剂有效的衍生化试剂为了确证为了确证L-FDLA的实用性，的实用性， L-FDLA的氨基的氨基酸衍生物使用以酸衍生物使用以frit-FAB 或或ESI作为接口的作为接口的LC/MS进行分析。

为了比较氨基酸的进行分析为了比较氨基酸的L-FDAA衍生物和衍生物和L-FDLA衍生物在相同条件下的电离衍生物在相同条件下的电离情况，两种衍生物的等量混合物进行情况，两种衍生物的等量混合物进行LC/MS分分析如Ffigure1所示所示DL-丙氨酸的丙氨酸的L-FDAA和和L-FDLA衍生物的衍生物的［［M+H］］+阳离子质量色谱，其整体质谱使用阳离子质量色谱，其整体质谱使用frit-FAB 作为接口作为接口L-FDLA衍生物的灵敏度衍生物的灵敏度比比L-FDAA衍生物的提高了三倍，这种趋势适衍生物的提高了三倍，这种趋势适合于任何常见氨基酸合于任何常见氨基酸对于对于ESI LC/MS，不管采用阳离子还是阴离，不管采用阳离子还是阴离子模式，灵敏度都提高子模式，灵敏度都提高2～～4倍由上可知，由上可知， L-FDLA不仅适用于不仅适用于HPLC分析，分析，也适用于也适用于LC/MS分析使用使用frit-FAB 和和ESI LC/MS的检测限分别为的检测限分别为10和和5pmol通常，天然存在的氨基酸都是由通常，天然存在的氨基酸都是由D-或或L-构构型的氨基酸组成的，每种氨基酸只能在色型的氨基酸组成的，每种氨基酸只能在色谱图上显示一个峰谱图上显示一个峰,绝对构型不能通过其他绝对构型不能通过其他方法来解决。

因此，为了从方法来解决因此，为了从D/L氨基酸获氨基酸获得一对对映体，进行外消旋化是很有必要得一对对映体，进行外消旋化是很有必要的最初使用的外消旋化方法为：最初使用的外消旋化方法为： 水解产物水解产物+醋酐醋酐+三乙胺三乙胺 唑酮中间体唑酮中间体 外消旋化的外消旋化的N-乙酰基氨基酸乙酰基氨基酸 水解水解 目标产目标产物物优点：对于肽中少数氨基酸来说是简单可行的优点：对于肽中少数氨基酸来说是简单可行的缺点：缺点：①①耗时；耗时；②②难于终止外消旋化作用；难于终止外消旋化作用；③③当氨基酸中含两个不对称碳原子（如苏氨酸、当氨基酸中含两个不对称碳原子（如苏氨酸、亮氨酸）时，就不能给出对映异构体的混合物，亮氨酸）时，就不能给出对映异构体的混合物，而是非对映体的混合物而是非对映体的混合物如上图所示，如上图所示，D-氨基酸的氨基酸的L-FDLA衍生物（衍生物（D－－L型）和型）和L-氨基酸的氨基酸的L-FDLA（（L－－L型）衍型）衍生物是非对映异构体，在色谱图上给出不同的生物是非对映异构体，在色谱图上给出不同的保留时间；保留时间；另一方面，另一方面，L－－D和和D－－L型、型、D－－D和和L－－L型型是对映异构体，每一对都显示相同的保留时间，是对映异构体，每一对都显示相同的保留时间，即某氨基酸的即某氨基酸的D- FDLA衍生物与该氨基酸的对衍生物与该氨基酸的对映异构体的映异构体的L-FDLA衍生物有相同的保留时间。

衍生物有相同的保留时间据此，有望以据此，有望以D- 和和L-FDLA的等量混合物代替的等量混合物代替只以只以L-FDLA做衍生化试剂，来得到前述的外做衍生化试剂，来得到前述的外消旋化作用消旋化作用上图还表明，用上图还表明，用D/L-FDLA进行衍生化是可行进行衍生化是可行的，该方法用于含两个不对称碳原子的氨基酸的，该方法用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，所得两个峰对应于原氨基酸和其对映异构时，所得两个峰对应于原氨基酸和其对映异构体的体的L-FDLA衍生物此外，化学外消旋化和此外，化学外消旋化和D/L-FDLA衍生化相结衍生化相结合用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，可能合用于含两个不对称碳原子的氨基酸时，可能在在HPLC谱中产生四个异构体峰谱中产生四个异构体峰小小 结结 至此，LC/MS联用的三个问题已得到解决：问题一：采用什么色谱技术来分离氨基酸我们采用Marfey法作为色谱技术问题二：怎样有效地将Marfey法与质谱联系起来我们采用ESI和Frit-FAB作为接口问题三：怎样能得到D-或L-氨基酸的对映体使用了用来衍生化的L-FDLA和用来外消旋化的D/L-FDLA代替FDAA。

这样就建立了一个运用这样就建立了一个运用LC/MS，称作，称作“advanced Marfey’s method”的非经验性方的非经验性方法，该法有三部分组成：法，该法有三部分组成：⑴⑴用于分离氨基酸的色谱技术：用于分离氨基酸的色谱技术： Marfey法；法；⑵⑵通过质谱方法检验氨基酸；通过质谱方法检验氨基酸；⑶⑶从从L-或或D-氨基酸得到相应的对映异构体的过氨基酸得到相应的对映异构体的过程本法的突出优点是：本法的突出优点是：①①可以在没有标准品的情况下确定绝对构型；可以在没有标准品的情况下确定绝对构型；②②可以同时分析肽链中的任何氨基酸可以同时分析肽链中的任何氨基酸应应 用用 举举 例例该法已经成功运用于肽链中氨基酸的结构确定该法已经成功运用于肽链中氨基酸的结构确定还用于研究伯胺类化合物、仲醇类化合物和含噻还用于研究伯胺类化合物、仲醇类化合物和含噻唑环的氨基酸等的绝对构型唑环的氨基酸等的绝对构型下面简要介绍一下运用该法对藻青菌下面简要介绍一下运用该法对藻青菌（（cyanobacteria）所产生的）所产生的microcystin LR中中的氨基酸的结构研究的氨基酸的结构研究Microcystin LR是一种毒性环肽，由七个氨基酸是一种毒性环肽，由七个氨基酸片段组成，其中片段组成，其中β-甲基天冬氨酸（甲基天冬氨酸（ β-MeAsp））分子中有两个不对称中心。

如下图分子中有两个不对称中心如下图Microcystin LR的水解产物被分成两部分，一的水解产物被分成两部分，一部分与部分与L-FDLA进行衍生化，另一部分与进行衍生化，另一部分与D/L-FDLA进行衍生化，衍生物先经过进行衍生化，衍生物先经过HPLC的二的二极管阵列检测器检测其极管阵列检测器检测其UV谱，然后以阴离子谱，然后以阴离子模式进行模式进行ESI LC/MS分析如如Figure5a所示为谷氨酸、所示为谷氨酸、 β-甲基天冬氨酸（甲基天冬氨酸（ β-MeAsp）、丙氨酸和亮氨酸的）、丙氨酸和亮氨酸的L-FDLA衍生衍生物以［物以［M-H］］ˉ值监测的质量色谱图，其中精氨值监测的质量色谱图，其中精氨酸的酸的L-FDLA衍生物是以［衍生物是以［M+TFA-H］］ˉ值进行值进行检测的五个氨基酸的与其检测的五个氨基酸的与其m/z值对应的峰在值对应的峰在质量色谱图上都有明确地显示质量色谱图上都有明确地显示该方法的另一个有点是能够发现任何非正常氨该方法的另一个有点是能够发现任何非正常氨基酸的反应产物，在这里基酸的反应产物，在这里3（（S））-Adda-L-FDLA峰就是这种情况峰就是这种情况。

在水解产物的在水解产物的D/L-FDLA衍生物的质量色谱上，衍生物的质量色谱上，有新产生的对映体峰（有新产生的对映体峰（Figure5b），根据其），根据其洗脱顺序得出结论：在洗脱顺序得出结论：在Microcystin LR中，中，精氨酸精氨酸(arginine)、和亮氨酸、和亮氨酸(leucine)具有具有L-构型，而谷氨酸构型，而谷氨酸(glutamic acid)、丙氨酸、丙氨酸(alanine)、和、和β-甲基天冬氨酸甲基天冬氨酸( β-MeAsp)具具有有D-构型由于由于Microcystin LR中的中的β-MeAsp的相对构的相对构型已被阐明为赤式，故它应为型已被阐明为赤式，故它应为D-赤式构型赤式构型另外，比较另外，比较m/z值为值为706的衍生物峰发现，在的衍生物峰发现，在质量色谱图上，质量色谱图上，L-FDLA衍生物要先于衍生物要先于D-衍生衍生物被洗脱下来，推测物被洗脱下来，推测Adda中的不对称碳原子中的不对称碳原子C-3具有具有S－构型。