基质金属蛋白酶与椎间盘退变.doc

1基质金属蛋白酶与椎间盘退变【关键词】 椎间盘与椎间盘退行性病变相关的临床综合征包括原发性下背部疼痛、颈腰神经根病、脊髓型颈椎病、腰椎管狭窄等椎间盘退变的特征性改变是髓核中蛋白聚糖含量的下降以及伴随的水份丢失目前，启动和调节这一过程的生物机制仍不十分清楚因而，在治疗手段和疗效上，缺乏明确的对应性和有效性以往认为椎间盘退变只是一种生物力学现象，但新近的研究表明生物力学的作用是次要的，更强调生物化学机制发挥着至关重要的作用椎间盘退变主要表现在细胞和细胞外基质（extracell matrix，ECM）成分的变化，而后者是椎间盘力学特征丧失的直接原因基质合成与降解的失衡将导致基质成分的紊乱，在此调节过程中一些生化机制发挥着重要作用其中基质金属蛋白酶（matrix metaloproteinases，MMPs）与金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metal-loproteinases，TIMPs）两个酶系统在椎间盘退变中的作用越来越为人们所重视1 椎间盘的结构及生化特征椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核三部分构成正常的椎2间盘由该三部分共同构成了起着对抗压力和张力的闭合缓冲系统，使椎间盘既有弹性亦能稳定脊柱，还能参与构成椎管，保护其内走行的神经血管［1］ 。

如同其他的结缔组织，椎间盘仅含有少量的细胞及丰富的细胞外基质，后者的主要成分为水、胶原和蛋白多糖、少量的弹性蛋白和年龄色素等［2］ 椎间盘退变将导致三种主要物质―胶原、蛋白多糖和水的改变［3］ 胶原如同绳索，蛋白多糖如同气球，三者的配布犹如在液体凝胶状态中拉紧的绳索网内充以无数的气球椎间盘根据负荷大小、水分多少、绳索拉紧和彼此缠结的牢固程度以及气球充气状态的改变，其形态及各种生理功能也发生改变，包括变形、营养供给、代谢状况和溶质输送等从力学上看，蛋白多糖能抵抗压应力，而胶原能抵抗张应力［4］ ，两者相互配合，以保持椎间盘的良好力学性能椎间盘细胞分为脊索细胞和纤维样细胞、软骨细胞样的 结缔组织细胞椎间盘细胞的密度小于其他结缔组织的细胞密度，约占组织的 1%～5%如关节软骨细胞的平均细胞密度为 14000 细胞/mm 3 ，而椎间盘细胞为 5800 细胞/mm 3 椎间盘不同部位的细胞密度和类型也不一样［5］ ，软骨终板的平均细胞密度为15000 细胞/mm 3 ，纤维环为 9000 细胞/mm 3 ，髓核为 4000细胞/mm 3 ，髓核内细胞在胚胎为脊索样细胞，在正常成人主要3以软骨样细胞为主，合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖。

纤维环外层为梭形的类成纤维细胞，主要合成Ⅰ型胶原，内层为圆形的软骨样细胞软骨终板细胞为典型的软骨细胞蛋白多糖存在髓核的胶原网架上，分子结构与关节软骨的蛋白多糖相似，在液体中能进行可逆压缩，对维持髓核组织的粘弹性及对抗压力起着重要作用蛋白多糖在椎间盘和软骨的 ECM 中主要以聚合体的形式存在胶原网和蛋白多糖共同维持髓核的凝胶状态蛋白多糖及核心蛋白的表达在髓核最高，由内向外逐渐减弱，且随着年龄的增长其表达出现降低趋势，蛋白多糖逐渐被富含胶原组织的纤维组织所替代，最后导致髓核纤维化，水分随之丧失变形的髓核组织弹性消失，硬度增加，失去均匀传递压力的作用，髓核易于从纤维环薄弱处脱出椎间盘组织中含有多种胶原成分，现已发现有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型、Ⅸ型、Ⅺ型等［6］ 胶原纤维是椎间盘的主要结构单位之一，其中Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘胶原的主要成分Eyre 等［7］ 利用溴化氰裂解、磷酸纤维素层析，发现Ⅰ型、Ⅱ型胶原是椎间盘组织中规律性的分布Ⅰ型胶原主要集中在纤维环的外层，占椎间盘Ⅰ型胶原总量的 40%能耐受牵张力，也是骨、肌腱、韧带、皮肤等组织的主要胶原成分由外层向髓核方向，Ⅰ型胶原逐渐减少，Ⅱ型胶原逐渐增加，髓核则主要为Ⅱ型胶原构成。

Ⅱ型胶4原是软骨胶原，在软骨、玻璃体和椎间盘髓核中含量丰富，耐受压力二者的共同存在和协同作用在维持椎间盘的力学特性中发挥重要作用［4］ 当其质和量发生变化时，必然引起椎间盘承受应力能力的降低和增加损伤的机会2 基质金属蛋白酶家族MMPs 是参与降解全身各种组织 ECM 的蛋白酶家族，自1962 年 Gross 和 Lapiere 首次报道胶原酶（Collagense）以来，作用于 ECM 其他成分的 MMPs 不断报道到目前为止已发现和纯化的 MMPs 至少有 20 种MMPs 通常由纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及肿瘤细胞产生，是一组锌离子依赖性蛋白酶，共同特征是其催化中心均需锌离子存在，其结构和氨基酸组成相似，分子结构中都含有 1 个 17～29 个氨基酸的单序列区、77～87 个氨基酸的前肽、含有锌离子结合位点的催化区、5～ 50 个氨基酸并富含脯氨酸的铰链区和约有 200 个氨基酸编码底物特异性的序列，其 cDNA具有同源性，以非活性形式分泌，通过蛋白水解作用激活，可被一些特殊的 TIMPs 和乙烯二胺四醋酸（ ethylene diaminete tracetic acid，EDTA ）所抑制［8］ 。

MMPs 有一些共同的生化特点 :a）催化机制依赖于活化中心的锌离子;b）蛋白酶均以无活性的酶原形式分泌;c）酶原可被蛋白酶激活因子或有机汞制剂激活;d）激活过程伴随分子量的减少;e）不同细胞来源的 MMPs 有很高的同源性;f）5激活后的酶可裂解一种或多种 ECM 成分;g）酶的活性可被 MMPs的天然抑制剂 TIMPs 抑制;h ）多数 MMPs 基因转录受到内源性生长因子和细胞因子调节，如白细胞介素（interleukin，IL ）-1 和 IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosing factor，TNF）-α 和 IFN-γ以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等根据表达的部位不同，MMPs 分为胞浆型和膜型两大类，前者分布在胞浆中，后者表达在细胞膜上，胞浆型 MMps 有胶原酶、基质溶解酶、明胶酶;膜型 MMPs 即膜蛋白酶［9］ 胶原酶中MMP-1、 8、13 具有高度同源性，MMP-1（胶原酶-1/ 成纤维细胞胶原酶）分布广泛，主要由成纤维细胞分泌，主要降解Ⅲ型胶原MMP-8 主要来源于多形核中性粒细胞，主要降解Ⅰ型胶原。

MMP-13 主要来源于软骨细胞，主要降解Ⅱ型胶原这三种胶原酶都在胶原分子 α 链的 Gly-ile/leu 键处降解胶原，产生 3/4 和 1/4原长的片段这些片段易被其他 MMPs 如明胶酶降解，故为降解胶原的关键酶［10］ 它们还能特异性地降解软骨内的Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，软骨内的糖胺聚糖也可被胶原酶裂解明胶酶（gelatinases）也称Ⅸ型胶原酶，包括 MMP-2（明胶酶 A）［11］ 、 MMP-9（明胶酶 B） ［12］ ，主要来源于多形核细胞、单核巨噬细胞、T 细胞、软骨细胞、转移性肿瘤细胞MMP-2 主要作用于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原，以及纤维结合蛋白、弹性蛋白6和蛋白多糖，所以能够有效地分解明胶，降解胶原溶解的初级产物基质溶解酶包括 MMP-3、10、11 ，基质溶解酶比胶原酶的作用底物范围广，其 作用底物主要是基质中蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白和明胶，它们还能降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原，MMP-3 还可降解 Ⅱ型胶原的非螺旋区MMP-3、7 还能降解软骨中蛋白多糖的核心蛋白，如可裂解糖胺聚糖分子的 Asn341-Phe342 部位，并能激活其他 MMPs，故为基质降解的主要酶类。

最近又确认了六种 MMPs:MMP-12、19 和四种膜蛋白酶类MMPs 可以用许多方法检测如免疫组化技术、酶联免疫吸附法、明胶酶谱学、RT-PCR 分析及同位素标记胶原底物降解分析法等MMPs 在许多生物过程中发挥重要作用，参与正常或病理条件下的组织重塑ECM 的完整性取决于其合成和降解之间的平衡，平衡的破坏将导致病理过程MMPs 与许多结缔组织疾病有关，如牙周病、肝脏纤维化、骨关节炎和类风湿关节炎等此外在恶性肿瘤的侵袭转移过程中也起着关键性作用［13］ 3 金属蛋白酶组织抑制剂家族TIMPs 是近年来发现的能特异性抑制 MMPs 活性的一组多功能因子家族TIMPs 家族是一个多基因家族的编码蛋白，可与MMps 的酶原和其活化形式相结合，常常由分泌金属蛋白酶的同一7细胞所合成TIMPs 家族由 4 个成员组成，依其被发现的先后顺序分别为 TIMP-1［14］ 、2、3 、4，其中 TIMP-1、2、4 为可溶性分泌蛋白，TIMP-3 是结合 ECM 的非可溶性蛋白TIMP-1 分子量为 28.5KDa 的糖蛋白，含有 184 个氨基酸和 6 个分子间二硫键，可与活化的间质胶原酶、活化的基质溶解素和 MMP-3 形成 1∶1 复合体［15］ 。

TIMP-2 分子量为 21KDa 的非糖蛋白，有 194 个氨基酸残基，其氨基酸序列有 65.6%与 TIMP-1 同源，37%完全相同，其中 12 个半胱氨酸残基及 4 个色氨酸中的 3 个位置是保守的，TIMP-2 可以 1∶1 非共价键形式与活化的 MMP-2 形成复合物，有效地抑制 MMP-2 的胶原分解活性及明胶活性，与 TIMP-1 不同的是 TIMP-2 既能结合无活性的 MMP-2 酶原，又能结合激活状态下的 MMP-2，而且可以终止 MMPs 家族中所有成员的水解活性TIMP-3 分子量为 21KDa 的 TIMP 家族新成员，其氨基酸序列与TIMP-1、TIMP-2 的同源性分别为 28%、42%［16 ］ ，它只存在于 ECM 中，可以阻碍转化的纤维母细胞对 ECM 的粘附，促进非转化细胞的增殖及转化表型的表达［17］ 刚分离出的 TIMP-4 分子量为 22.6Kda，有 224 个氨基酸，与 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3分别有 37%、51%、51%相同［10］ TIMPs 与 MMPs 各成员之间存在相互调节的作用，使得 MMPs 和 TIMPs 在一定程度上保持协调平衡的关系。

TIMPs 主要从两个方面抑制 MMPs 的激活:a）在酶原活化阶段，可与 proMMPs 形成稳定的复合体，并阻碍其自我合成;b）在活化的 MMPs 阶段，可直接与活化的 MMPs 以 1∶18分子比例非共价结合，进而抑制其活性，这种结合是不可逆且稳定的关于 TIMPs 的作用机制尚不清楚，有人推测 TIMPs 可能通过其 17、19 位点的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸与 MMPs 的S′1、 S′2、 S′3 区结合，使 MMPs 第 16 位上的天冬氨酸残基的羟基作用于活性中心的锌离子，从而抑制其活性尽管每种 TIMPs 都能抑制所有的 MMPs，但目前的证据表明，TIMP-2 对 MMP-2 的活性特别重要，而 TIMP-1 主要抑制 MMP-1、MMP-3、MMP-94 基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂在椎间盘退变中的作用随着年龄的增加，椎间盘逐渐发生退行性变化Ⅰ型胶原取代Ⅱ型胶原、出现Ⅲ型胶原及Ⅹ型胶原，非还原性共价交联累积，蛋白多糖特别是聚合体含量下降，髓核水化减少等是退变椎间盘基质成分的主要生化改变，异常或过量的 MMPs 的出现是其重要原因其中 MMP-3 是降解 ECM 的主要酶，其作用底物广泛，蛋白多糖聚合体及椎间盘内多种基质成分，减少髓核的亲水作用。

通过降解连接蛋白破坏核心蛋白的透明质酸结合区分解蛋白多糖聚合体，此外还可以降解多种胶原、层粘素、纤维连接素、明胶、基底膜和结缔组织，并且可以通过激活其他 MMPs 起作用［8，10 ，13］ 研究表明正常软骨内 MMPs 的生物活性明显升高、且 mRNA 的表9达也增高，MMPs 与 TIMPs 的平衡破坏引起软骨破坏［13 ，18］ 椎间盘的基质成分与关节软骨相似。