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上细菌的分离与鉴定单位：燕山大学建筑与环境化学工程系 09 级生物制药 2 班秦皇岛市河北大街 438 号，邮编：066004摘要： 随着信息技术的发展，交流已成为人们沟通的主要方式，但与我们的皮肤接触频繁，如果上存在细菌，这就成为一种病原体传播的途径，对人们的皮肤等健康问题构成不同程度的伤害为了证明上存在有对我们使用者健康有危害的细菌，经由细菌提取、培养、观察、分离、纯化、计数、鉴定（糖发酵试验、硫化氢实验、大分子水解实验和 IMViC 实验）以及保存等一系列步骤，从表面分离得到两种细菌并对其进行了鉴定分析，得出了结论：上确实存在大量的细菌，它们对人类的健康构成了一定的危害，所以我们应该特别注重平时的卫生习惯，如勤洗手Abstract：With the development of information technology, mobile communication has become the main way people communicate, but handset frequent skin contact with us, if the phone is there bacteria, which become a kind of pathogen transmission, such as on people's skin and pose health problems varying degrees of damage. In order to prove the existence of mobile phone users of our health hazards of bacteria by bacterial extraction, training, observation, the separation, purification, counting, appraisal ( sugar fermentation tests ，hydrogen sulphide experiment, macromolecules,and IMViC experiment) and the preservation of and a series of steps, from cell phones and two types of bacteria isolated from the surface was carried out identification , a conclusion: the existence of the phone number of bacteria, they constitute a certain human health hazards, we should pay special attention usual health habits, such as washing hands frequently.关键词：；健康；病原体传播；细菌提取；鉴定分析Keywords：cellphone；health； bacterial extrac；pathogen transmission； identification and analysis1.引言 现在已成为我们生活中不可缺少的一部分，但是人们却忽略了它们给我们带来的危害。

我们的表面有大量的细菌，我们很少去关注，且很少对其进行一定的清洁工作表面上存在大量的细菌，通过与手的接触，加上不良好的卫生习惯，很可能导致病从口入专家还指出，蠕动的致命细菌接触到面部等部位，可能引致暗疮、肺炎、脑膜炎，甚至超级病毒金黄色葡萄球菌我们此次试验的目的就是通过对表面细菌的研究，确定其所含菌的数量和种属，确定它们的存在及危害，从而引起人们的关注建议人们对进行定期的卫生工作，如使用时可用除菌纸巾定期擦拭，定期消毒，以减少我们受感染的机会，勤洗手是最基本的卫生习惯 2.材料方法2.1.材料：2.1.1 实验器材：2.1.2 实验仪器：普通光学显微镜、接种环、酒精灯、培养皿、载玻片、镊子、烧杯、试管、移液管、德汉氏小管、恒温培养箱、目镜测微尺、镜台测微尺等2.1.3 培养基种类牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，蒸馏水）油脂培养基（蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，香油，1.6%中性红水溶液，琼脂，蒸馏水）淀粉培养基（蛋白胨，氯化钠，牛肉膏，可溶性淀粉，蒸馏水，琼脂）蛋白胨水培养基（蛋白胨，氯化钠，蒸馏水）明胶培养基（牛肉膏蛋白胨液，明胶）糖发酵培养基（蛋白胨水培养基，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，20% 糖溶液（葡萄糖，乳糖，蔗糖） ）柠檬酸盐培养基（磷酸二氢铵，磷酸氢二钾，氯化钠，硫酸镁，柠檬酸钠，琼脂，蒸馏水，1% 溴香草酚蓝乙醇液）醋酸铅培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂，硫代硫酸钠，10%醋酸铅水溶液）石蕊牛奶培养基（牛奶粉，石蕊，水）尿素琼脂培养基（尿素，琼脂，氯化钠，磷酸二氢钾，蛋白胨，酚红，蒸馏水）2.2.方法2.2.1.细菌的提取分离（1）细菌的提取：用蘸有生理盐水的消毒棉签在表面一平方厘米的范围内涂抹，然后将该棉签浸入到盛有一毫升生理盐水的试管中，配成原倍数的菌悬液，然后再配成稀释十倍的菌悬液。

2）细菌的培养：用灭菌后的移液管移取菌悬液，将 1-2 滴滴入培养皿中，用涂布棒将菌分布均匀，每种菌分别做两个平板，放在 37℃恒温培养箱中培养 24 小时3）细菌的计数：取出培养好的平板，观察菌落的多少，记下菌落数的多少（4）细菌的纯化：挑取菌落上的细菌，用三段划线法对其进行纯化放入 37℃培养箱中培养，直至所得菌落为单个菌落2.2.2. 细菌的观察（1）细菌的形态大小观察：无菌操作取菌，制成菌悬液滴一滴到载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察其形态校正目镜测微尺计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度，然后观察细菌的大小2）革兰氏染色：制片—初染（结晶紫染色 1~2min,倾去染液）—媒染（碘液覆盖 1min,倾去碘液）—脱色（95%乙醇脱色 20~30s）—复染（复红染色 2min,水洗）—镜检2.2.3.糖发酵试验：（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名2）取葡萄糖发酵培养基试管 3 支，分别接入两种菌，第三只不接种，作为对照另取乳糖发酵培养基试管 3 支，同样接入两种菌，第三只不接种，作为对照蔗糖发酵同上3）将接过种和作为对照的 6 支试管均置 37℃中培养 24-48h。

4）观察各试管颜色变化及德汉式小管中有无气泡2.2.4.大分子水解实验：Ⅰ 淀粉水解实验（1）将固体淀粉培养基溶化后冷却至 50℃左右，无菌操作制成平板2）用记号笔在平板底部划成 2 部分3）将两种菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上两种菌的标号4）将平板倒置在 37℃温箱中培养 24h5）取出平板，观察菌苔颜色Ⅱ 石蕊牛奶实验：（1）取两只石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名2）分别接种两种菌3）将接种后的试管置 35℃中培养 24-48h4）观察培养基颜色变化Ⅲ .明胶水解实验：（1）取两只明胶培养基试管，用记号笔标明各试管欲接种的菌名2）用接种针分别穿刺接种两种菌3）将接种后的试管置 20℃中培养 2-5d4）观察明胶液化情况Ⅳ 油脂水解实验：（1）将熔化的固体油脂培养基冷却至 50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝2）用记号笔在平板底部划成两部分，分别在两部分标上军的标号3）用无菌操作将两种菌分别划十字线接种于平板的相应部分的中心4）将平板倒置，37℃温箱中培养 24h5）取出平板，观察菌苔颜色 Ⅴ 尿素试验：（1）取两只尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。

2）分别接种两种菌3）将接种后的试管置 35℃中培养 24-48h4）观察培养基颜色变化2.2.5.IMViC 实验Ⅰ 吲哚试验：将两种菌分别接入 2 支蛋白胨水培养基中，置 37℃培养 48h于培养 48h 后的蛋白胨水培养基内加入 3-4 滴乙醚，摇动数次，静置 1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入 2滴吲哚试剂在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应Ⅱ 甲基红实验：将两种菌分别接入 2 支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置 37℃培养 48h培养 48h 后，将1 支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂 2 滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性Ⅲ 伏-普实验：将甲基红实验中的另一支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入 5-10 滴 40%KOH，然后加入等量的 5%α- 萘酚溶液，用力震荡，再放入 37℃温箱中保温 15-30min.，以加快反应速度，若培养物呈红色者，为伏-普反应阳性Ⅳ 柠檬酸盐实验：将两种菌分别接入 2 支柠檬酸盐斜面培养基中，置 37℃培养 48h培养 48h 后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色，蓝色为阳性，绿色为阴性2.2.6.硫化氢实验：用接种针将两种菌分别穿刺接入 2 支醋酸铅培养基中，置 37℃培养基 48h。

观察黑色硫酸铅是否产生3.结果3.1.通过对细菌的分离纯化及培养，我们得到两种菌的菌落稀释十倍的菌悬液通过平板计数法记录菌落数为 42 个又对其进行细菌的大小、形态观察及革兰氏染色，观察结参表一表一 细菌的观察结果菌名 形态 大小 颜色 革兰氏染色①号 边缘整齐，湿润，表面光滑，圆形0.8μm 淡黄色 红色②号 边缘整齐，湿润，表面光滑，金黄0.6μm 金黄色 蓝紫色色稀释十倍的菌悬液培养后所得菌落如图一，简单染色如图二图一：稀释十倍的菌悬液菌落 图二：简单染色3.2 糖酵解实验绝大多数细菌能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气发酵培养基含有蛋白胨、指示剂、倒置的德汉氏小管和不同的糖类当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可有紫色变为黄色气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明结果如下表二表二 糖酵解实验结果糖类发酵 ①号 ②号 对照葡萄糖发酵 产酸产气 产酸不产气 不产酸不产气蔗糖发酵 产酸产气 产酸不产气 不产酸不产气乳糖发酵 产酸产气 产酸不产气 不产酸不产气3.3 大分子水解实验微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能吸收利用。

Ⅰ 淀粉水解实验：淀粉酶水解淀粉为小分子糊精、双糖和单糖，淀粉遇碘会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定时不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶①号菌周围无现象，②号菌周围有透明光圈现象如图三图三：淀粉水解实验现象Ⅱ 油脂水解实验：脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，脂肪水解后产生脂肪酸，可以改变培养基的 pH 值，使 pH 降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶现象：①号菌苔周围出现红色斑点，为阳性；②号菌苔周围也出现红色斑点，为阳性Ⅲ 明胶水解实验：明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在 25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在，而在 25℃以上明胶会液化有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在 4℃仍能保持液化状态现象：两种菌都使明胶液化，均为阳性Ⅳ 石蕊牛奶实验：有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶来检测石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊配制而成，是浑浊的蓝色，酪素水解成氨基酸和肽后，培养基会变得透明两培养基都为白色，均为阳性Ⅴ 尿素实验：尿素是有大多数哺乳动物消化蛋白质后分泌在尿液中的废物。

尿素酶能分解尿素释放。