冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价.docx

    冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价    侯飞侠+曹静+王沙沙++王茜+袁媛+彭成+万德光+国锦琳[摘要]冬虫夏草为我国传统名贵中药材资源短缺、价格昂贵和巨大的市场需求导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重，亟需建立快速有效的鉴别方法该研究基于实验前期已建立的冬虫夏草快速鉴定SSPCR方法，按照体外诊断试剂评价标准开发试剂盒，并对试剂盒的特异性、检测限、重复性及保存期4项性能进行了评价结果显示冬虫夏草质量占混合物质量的1/200（质量分数05%以上）以上时可被成功检测试剂盒对冬虫夏草及其伪品的检测结果显示，仅有冬虫夏草可被成功扩增，并在紫外下显示绿色荧光该试剂盒37 ℃温育7 d仍有效，说明4 ℃保存其在1年内稳定有效同一批次试剂盒在不同条件下，不同批次试剂盒在相同条件下，其检测结果均一致且准确，表明试剂盒具有良好的批内及批间重复性将该试剂盒用于市售冬虫夏草及其混伪品的检测，操作简单快速，结果准确可靠，为下一步中药快检试剂盒的商品化奠定了基础[关键词]冬虫夏草； 聚合酶链式反应（PCR）； 检测试剂盒Development and evaluation of[Abstract]Ophiocordyceps sinensis is a valuable traditional Chinese medicine. Due to resource shortage， expensive price and huge market demand， there are many adulterants of O. sinensis in markets. Therefore， it is necessary to establish a rapid and effective method for distinguishing O. sinensis. Based on the speciesspecific PCR of O. sinensis， this study developed a detection kit by optimizing the components and evaluated the specificity， detection limit， repeatability and shelf life of the kit. The results showed that when the quality of O. sinensis accounted for more than 1/200 of that mixture， it could be detected successfully. Moreover， only O. sinensis could be amplified and glowed bright green fluorescence under ultraviolet light. The kit was still in effect when it was placed at 37 ℃ for three days， which indicated that it was stable and effective for one year stored in 4 ℃. The kit in the same batch under different operation conditions， and in different batch under the same operation conditions gave the same result and accuracy， which showed good repeatability of the kit. It is simple， rapid and accurate to distinguish O. sinensis from its adulterants using the kit， and lays the foundation for commercialization of traditional Chinese medicine fast detection kit.[Key words]Ophiocordyceps sinensis； PCR； detection kit冬虫夏草是麦角菌科真菌冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1]，具有补肾益肺，止血化痰的功效，临床用于治疗肾虚精亏，久咳虚喘等症，为我国传统名贵中药材。

由于野生資源有限且受到过度采挖，规模化的人工培育也尚未实现，导致冬虫夏草价格昂贵巨大的市场需求也导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象严重，亟需建立快速有效的鉴别方法现有的冬虫夏草真伪鉴别方法包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别和DNA条形码技术[2]等形状鉴别主要通过观察冬虫夏草虫体和子座的颜色、大小、足的数目、气味等[36]显微鉴别主要观察虫体中央的结构、躯壳表皮有无着生绒毛、躯壳内有无菌丝、子座横、纵切面、子囊壳的包埋位置、子囊壳及子囊孢子形态、大小等[35， 7]理化鉴别包括：紫外吸收光谱法[8]、红外光谱法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、蛋白电泳法[12]、免疫分析法[13]等以上鉴定方法均需要鉴定者具有一定的理论基础和丰富的实践经验，同时耗时长，多需要大型仪器支持，推广难度较大而DNA条形码技术是基于不同物种的遗传信息载体DNA的差异性来进行物种鉴别，具有稳定性高，重复性好的特点，但是该技术基于测序分析需要测序仪等大型仪器，实验投入大，周期较长，而且对NCBI等数据库依赖性强，准确度值得商榷由此可见，目前的冬虫夏草鉴别方法均不能满足快速而有效的鉴定要求本研究基于实验前期已建立的冬虫夏草快速鉴定SSPCR（speciesspecific PCR）方法，开发冬虫夏草快速检测试剂盒。

1材料与方法 11样品本文所用样品均经成都中医药大学国锦琳教授鉴定，凭证样品保存于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室，样本信息见表112试剂盒的组成冬虫夏草PCR快速鉴定试剂盒规格为50次/盒，试剂组成见表2，其中Primer premix为1对冬虫夏草特异引物（SIF6： 5′TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT3′，SIR6：5′GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC3′），根据其rDNA ITS序列的特异性位点设计而来，扩增片段大小为174 bp以冬虫夏草基因组DNA为阳性对照，无菌ddH2O为阴性对照13试剂盒的使用试剂盒使用方法如下：①改良碱裂解法快速提取虫草基因组DNA在约10 mg虫草子座粉末中加入80 μL Buffer A，混匀，再加入160 μL Buffer B混匀后，静置5 min，取上清液即得虫草基因组DNA②PCR扩增：扩增体系为25 μL /PCR，包含125 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL Primer premix，待检样品或阳、阴性对照品 1 μL，补充ddH2O至25 μL；扩增程序为94 ℃预变性1 min，然后进行30个循环，条件为94 ℃变性30 s，67 ℃退火并延伸30 s。

③荧光检测：在扩增产物中加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ混匀后，置紫外灯下观察是否显示绿色荧光，若显示，则为冬虫夏草，反之，则为伪品侯飞侠等：冬虫夏草PCR快速检测试剂盒的研制与效果评价14试剂盒的性能检测参考2015年版《中国药典》三部生物诊断试剂盒的要求[14]，对试剂盒的特异性、检测限、重复性和保存期等性能进行了考察141特异性以表1所列虫草的基因组DNA为模板，用本研究开发的试剂盒进行特异性检测142检测限分别将质量为5，125，25，50，100，200，400，5 000 μg的冬虫夏草子座粉末混匀于蛹虫草子座粉末中，使混合粉末的质量为5 mg，再分别用试剂盒进行检测143重复性随机取同批次组装的试剂盒3盒，分别在不同操作条件（不同操作时间、人员、地点、人员以及不同型号的PCR仪）下对阳性对照和阴性对照进行检测，考察批内重复性，见表3随机选取3盒不同批次的试剂盒，在相同的试验条件下对阳性对照和阴性对照进行检测，考察批间重复性144保存期参考生物诊断试剂盒保存期加速破坏试验，37 ℃保存3 d后仍有活性，表明该试剂盒可在4～8 ℃保存6个月，37 ℃保存7 d后仍有活性，表明该试剂盒可在4～8 ℃稳定保存1年。

本研究将试剂盒分别置于37 ℃ 3 d和7 d后取出对阳性对照和阴性对照进行检测，考察试剂盒的保存期15应用使用该试剂盒，分别对成都荷花池中药材专业市场销售的冬虫夏草12份，伪品及金针虫虫草Cordyceps agriota各6份进行检测2结果21试剂盒的特异性及检测限利用该试剂盒对表1所列的冬虫夏草、凉山虫草、蛹虫草、古尼虫草及蝉花进行检测仅有冬虫夏草可扩增出174 bp的目的条带在扩增产物中加入核酸染料SYBR Green I后，仅有冬虫夏草显示绿色荧光，结果见图1冬虫夏草和蛹虫草不同比例混合的5 mg粉末采用本试剂盒进行检测，结果发现，含有25 μg及以上质量的冬虫夏草可显示绿色荧光，即冬虫夏草与混合物的比例为1∶200以上时可被成功检测，见图222试剂盒的重复性从2015年12月19日组装的试剂盒中随机选取3盒，在不同操作条件（不同操作时间、地点、人员、仪器）下分别对阳性对照和阴性对照进行测试结果表明，阳性对照在紫外下均显示绿色荧光，阴性对照均无，说明试剂盒具有良好的批内重复性，见图3在相同的操作条件下，利用3盒不同批次的试剂盒分别对阳性和阴性对照进行检验，结果显示，陽性对照均显示绿色荧光，阴性对照则不显示，说明试剂盒批间重复性良好，见图4。

23试剂盒的保存期试剂盒中NaOH和TrisHCl在常温下性质稳定，而引物、含有DNA Taq酶和dNTP的2×Taq PCR master mix需在-20 ℃冻存以保持活性试剂盒的保质期表现了试剂盒在未经使用时本身的稳定性，本研究参考药典规定的生物制剂试剂盒的保存期加速破坏试验，测试结果见图5，37 ℃温育3 d，阳性对照仍可被有效扩增，37 ℃温育7 d，阳性对照仍能被有效扩增保存期考察表明，试剂盒4 ℃保存在1年内稳定有效24试剂盒的实践应用采用本研究研制的试剂盒分别对市售的12份冬虫夏草，6份伪品虫草和6份金针虫虫草进行检测结果见图6 12份冬虫夏草的试剂盒检测均为阳性，而12份非冬虫夏草的试剂盒检测为阴性，说明该试剂盒可用于检测市售冬虫夏草的真伪3讨论冬虫夏草产于青藏高原海拔3 000 m以上的高山草甸及灌木丛下，近年来由于全球变暖导致雪线上移，寄主昆虫蝙蝠蛾大量死亡，加之过度采挖，野生资源下降明显，目前尚无规模化的人工培育技术，但市场需求巨大，供需矛盾日益显著全世界冬虫夏草的近缘物种有近300种，部分形态与冬虫夏草相似度极高，常规形态鉴别方法难以区分，粉末、饮片等加工品更是难以鉴别，导致市售冬虫夏草掺伪掺假现象频发[15]，严重影响临床用药安全和人民健康。

现鉴定方法大多对实验环境、操作人员经验要求高，操作复杂，多需大型仪器，推广应用有一定的难度而物种特异性PCR（speciesspecific PCR，SSPCR）扩增技术，通过设计高特异性的引物，序列经PCR扩增后，通过检测靶标片段的有无，从而实现鉴别物种的目的该技术特异性强，同时通过电泳图谱实现定性鉴别，省去测序分析等，降低成本，节约时间目前已运用SSPCR方法成功鉴别了白花蛇舌草[16]、金银花[17]、蕲蛇[18]、乌梢蛇。