侵染广西红宝石青柚的柑橘褪绿矮化相关病毒遗传进化分析.docx

    侵染广西红宝石青柚的柑橘褪绿矮化相关病毒遗传进化分析    李战彪 刘丽辉 崔丽贤 陈锦清 朱英芝 李霁轩 谢慧婷 秦碧霞 蔡健和Summary：【目的】明确引起广西多地泰国红宝石青柚产生叶片变形、扭曲、皱缩、褪绿花叶和矮化症状的病原，为有效防治该病害提供理论依据方法】从广西多地采集疑似发病的红宝石青柚叶片样品，利用柑橘褪绿矮化相关病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）特异引物进行PCR检测，通过分段扩增、克隆等方法对样品进行鉴定并获取全长基因序列，運用RDP5和MEGA 7.0对所获得的全长基因序列进行重组及遗传多样性分析结果】PCR检测结果显示采集的红宝石青柚叶片样品可扩增出642 bp的目的条带，证实红宝石青柚受到CCDaV感染;采用分段克隆的方法获得LA-1、LA-2、WM-1、GG-1、GG-2、WZ-1和WZ-2等7个各地代表分离物的全长序列，序列长度分别为3641、3642、3642、3640、3642、3644和3644 bp;核苷酸相似性比对发现，7个分离物间的核苷酸相似性在98%以上，与GenBank已登录的CCDaV各分离物间的核苷酸相似性在99%以上，说明研究获得的病毒分离物为CCDaV的分离物;重组分析发现，7个分离物未发生重组。

系统发育进化树分析结果显示，研究获得的WZ-1和WZ-2分离物分别与Tha1-19、Tha30处于同一个小分支，说明这2个分离物与Tha1-19和Tha30具有较近的亲缘关系;其余几个分离物则分处不同的小分支，说明CCDaV广西分离物间仍有一定的进化多样性结论】引起广西红宝石青柚叶片呈V字型、皱缩、卷曲、褪绿花叶和植株严重矮化等症状的病原为CCDaV，部分地区分离物存在地域多样性Key： 柑橘褪绿矮化相关病毒;红宝石青柚;遗传进化;广西： S432.1                         文献标志码： A ：2095-1191（2021）10-2758-07Abstract：【Objective】To clarify the pathogen of the Ruby green pomelo showing symptoms of leaf deformation， curling， shrinking，chlorotic and dwarfing， and provide a theoretical basis for effective prevention and treatment of the disease.【Method】 Several leaf samples were collected from suspected Ruby green pomelo in some cities of Guangxi， and two pairs of specific primers of Citrus chlorotic dwarf-associated virus（CCDaV） were designed and used for detected the suspected samples， the full-length of genome sequence were obtained by segmented amplification and gene cloning. RDP5 and MEGA 7.0 softwares were applied for analyze the recombination and the genetic diversity of the full length genome. 【Result】PCR with expected size of 642 bp were obtained from all of the collected Ruby green pomelo samples， which confirmed that all of the samples were infected by CCDaV. The full-length genome sequences of seven locations representing isolates LA-1， LA-2， WM-1， GG-1， GG-2， WZ-1 and WZ-2 were obtained by using segmented amplification and gene cloning， and the full-length sequences of the seven isolates were 3641， 3642， 3642，3640， 3642， 3644 and 3644 bp， respectively. The nucleotide sequence identities between the seven isolates were over 98%， and the identities against other CCDaV isolates available in GenBank were over 99%， this results showed that the seven isolates obtained in this research were CCDaV isolates. Recombination analysis showed that no recombination occurred in the seven isolates. Phylogenetic analysis showed that two CCDaV Guangxi isolates（WZ-1 and WZ-2） clustered with Tha1-19 and Tha30 in a sub-clade， indicating their close relation. The other isolates of Guangxi were distributed in different sub-clade， indicating that there were evolutionary diversity among the CCDaV Guangxi isolates. 【Conclusion】 CCDaV is the pathogen that infects the Ruby green pomeloshowing symptoms of V shape， shrinking， curling， chlorotic and dwarfing， and there is regional diversity of the isolates among different regions.Key words：Citrus chlorotic dwarf-associated virus; Ruby green pomelo; genetic and evolutionary; GuangxiFoundation item：Guangxi Innovation Driven Development Special Fund Project（GuikeAA18118046-1，GuikeAA18 118046-5）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021YT071）0 引言【研究意義】近年来，我国柑橘产业发展迅猛，特别是在广西，柑橘产业已成为带动地区脱贫、农村就业的支柱产业。

但柑橘产业快速发展也带来了诸多问题，病虫害的区域间发生流行已成为不可忽视的问题随着柑橘种植面积不断扩大和新品种引进种植，区域间种苗调运频繁，由于难于监管，导致多种病虫害通过种苗携带传播流行，并造成严重危害，其中，病毒病害尤其突出本研究团队2019年发现新引种的红宝石青柚上发生一种疑似新的病毒病害，对广西柑橘产业存在潜在威胁，而明确该病害的病原可为该病害流行规律及防控技术研究提供指导前人研究进展】柑橘病毒病是一类严重影响柑橘产量及质量的重要病害目前世界上已报道的柑橘病毒及类病毒有30余种（吴佳星，2020）;在我国，柑橘生产上主要的病毒有11种：柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘褪绿矮化相关病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV）、柑橘叶斑驳病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）、柑橘树皮裂纹类病毒（Citrus bark cracking viroid，CBCVd）、柑橘鳞皮病毒（Citrus psorosis virus，CPsV）、柑橘类病毒V（Citrus viroid V，CVdV）和柑橘类病毒VI（Citrus viroid V，CVdVI）（张艳慧等，2017）。

其中，柑橘褪绿矮缩病是近年来新发生的柑橘病毒性病害，其病原是柑橘褪绿矮化相关病毒（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）CCDaV基因组为单链DNA，属于双生病毒科（Geminiviridae），主要通过嫁接、刀割和杨梅粉虱（Parabemisia myricae Kuwana）进行传播;该病毒可侵染大多数的柑橘类作物，早期症状出现在春季的嫩叶上，主要症状特征包括叶片呈现V字型，同时伴随有叶片变形、扭曲、花叶和节间变短等症状，严重影响柑橘产量和质量（Korkmaz et al.，1995; Richard et al.，2008; Loconsole et al.，2012）20世纪80年代末期，该病害最早发生于土耳其的地中海区域，给土耳其柑橘产业造成极大危害，特别是葡萄柚，产量损失超过50%以上（Korkmaz et al.，1995; Kersting et al.，1996; Loconsole et al.，2012）2008年，在我国云南瑞丽一个酸橙果园上首次发现该病害，但发病率较低，未引起广泛关注（Guo et al.，2015）。

2017年，Zhou等对该病在我国的分布进行调查，结果发现CCDaV仍只发生在我国的云南省2020年，Yang等在泰国也发现并报道了该病前人的研究结果证实，柑橘褪绿矮化病正在向全世界的柑橘产区扩散蔓延，应引起重视本研究切入点】近年来，广西柑橘产业发展迅猛，新品种泰国红宝石青柚在广西得到迅速推广种植2019—2020年，本研究团队在广西南宁、贵港等多地柑橘育苗场和果场走访、调查，发现泰国红宝石青柚存在叶片变形、扭曲皱缩、褪绿花叶和矮化等疑似CCDaV病毒感染症状，发病率高达10%～15%，但引发该类症状的病原尚未明确拟解决的关键问题】利用分子生物学手段对疑似柑橘褪绿矮缩病病样进行检测、鉴定，明确引发该类症状的病害病原，并通过分段克隆的方法获取相关病毒病原的全序列基因组，运用RDP和MEGA等软件分析该病毒病原的来源和进化规律，为红宝石青柚上柑橘褪绿矮缩病的防控打下理论基础1 材料与方法1. 1 试验材料2019年11月—2020年11月，分别从广西梧州市藤县太平镇（东经。