手性药物的拆分高效液相色谱HPLC课件.ppt

Dalgliesh 三点相互作用 dXYabcABCD(S)-选择剂（R)-对映体dXYabcABCD(S)-选择剂（R)-对映体三点相互作用模型 排斥作用通常为立体排斥，偶极-偶极排斥 键合作用包括氢键，静电，偶极-偶极吸引，电荷转移和疏水作用 根据固定相的不同,与对映体之间存在以下几 种作用 ?（1）过渡金属离子的手性配位作用 ?（2）π-π电荷转印相互作用 ?（3）包结络合作用 ?（4）氢键相互作用 ?（5）立体契合作用 1 手性固定相 ?第一类包括低聚糖，多糖及其衍生物，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯等 ?a，纯有机聚合物 ?b，聚合物涂覆在无机载体上 ? c，接枝聚合物 ?第二类是把光学活性分子通过离子键或共价键连接到硅胶载体表面，应用的光学活性物质有氨基酸衍生物，冠醚，金鸡纳生物碱，糖类，胺类，酒石酸衍生物，环糊精和联二萘酚等 1.1纤维素衍生物手性固定相 ?1.纤维素-三（苯甲酸酯）（CTB）固定相 ? 由微晶纤维素和苯甲酰氯反应： OOHOHHOOHCOCln+OOCOHOOCOOCOn将得到的纤维素-（三苯甲酸酯）涂敷在氨丙基硅烷化硅胶上， 便得到CTB固定相 ?2.纤维素-三（苯基氨基甲酸酯）（ CTPC） ? 由微晶纤维素与异氰酸苯酯反应，将得到的纤维素-三（苯基氨基甲酸酯）涂敷在氨基键合的硅胶上，便得到CTPC手性固定相: OOHOHHOOHNCOn+OOCONHHOOCONHNHOCOn?3.纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC） ?商品名为手性OD柱，具有极高的光学拆分能力，是广泛使用的手性固定相之一。

以微晶纤维素与3，5-二甲基苯基异氰酸酯反应，将生成的纤维素-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）以15%的量涂敷在氨丙基硅胶上，制得CDMPC-CSP： OOHOHHOOHNCOH3CH3Cn+OOCONHHOOCONHCH3CH3CH3CH3NHOCOH3CCH3n1.2 淀粉类手性固定相 ?最基本的有如下4种 OOCONHHOOCONHnNHOCORRR直链淀粉OOCOROCORHOHOCORnOOCOROCORHO直链淀粉1.R=H，直链淀粉 -三（苯基氨基甲酸酯）2.R=3，5-（CH3）2，直链淀粉 -三（3，5，-二甲基苯基氨基甲酸酯）3.R=C6H5，直链淀粉 -三（苯基甲酸酯）4.R=3，5-（CH3）C6H5NH，直链淀粉 ——三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）?淀粉手性固定相的制备方法与纤维素手性固定相相似，首先用淀粉与相应的有机化合物，如苯甲酰氯，苯基异氰酸酯等反应，得到淀粉衍生物，再将这种衍生物涂敷在氨丙基键合硅胶上，便可以得到淀粉类手性固定相 1.3 环糊精手性固定相 ?-CD环状构型（俯视图） 环糊精包封药物的立体结构环糊精包封药物的立体结构 环糊精分子中每个葡萄糖单元含有5个手性碳原子，如β-CD含有35个手性碳原子，同时与各种有机分子形成包容配合物，分子整体上具有光学活性和立体识别能力，是一种理想的手性选择剂 OOHHOOHOOOHHOOHOOOHOHOHOOOOHOHHOOOHOHHOOOOHHOHOOCD及衍生化CD化学键合手性固定相键合方式： ?1.胺键连接 氨丙基硅胶键合相与环糊精反应： SiO2OOSiOSiO2CH2CH2CH2NH2OOSiOCH2CH2CH2NHHO+?2.酰胺键连接 羧基化的氨丙基硅胶键合相与乙二胺环糊精反应： SiO2OOSiOSiO2OOOSiCH2CH2CH2NHCOCH2CH2COOHCH2CH2CH2NHCOCH2CH2CONHCH2CH2NHHNH2CH2CNH2+?3.碳氧键连接 醚基键合相与环糊精反应，： SiO2OOSiO(CH2)3oCH2CHCH2OSiO2OOOSiCH2CH2CH2OCH2CHOHCH2OHO+这种键合方式不含氮键，固定相的稳定性好。

1.4 多模式环糊精固定相 ?环糊精衍生化固定相既可以用于反相分离又可以用于正相分离，因而称为多模式手性固定相手性识别作用既有包容络合，又有π-π电荷转移，氢键和立体排斥相互作用等多种作用，应用范围广泛 ?制备过程有四个步骤： ?（1）硅胶上键合N-（2-氨乙基-3-氨丙基）基团 ?（2）用对甲苯磺酰氯专一性的磺化环糊精的羟基 ?（ 3）2-氨乙基-3-氨丙基键合硅胶与甲苯磺酰氯-β-环糊精反应；通过N-（2-氨乙基-3-氨丙基）键合硅胶上的氨基与环糊精上的甲苯磺酰基之间发生反应，把环糊精链接到硅胶上 ?（4）环糊精上未反应的甲苯磺酰基与各种改性剂进一步反应，得到改性的环糊精键合固定相 β-CD固定相改性过程 SiO2OH(CH3O)3Si(CH2)3NH(CH2)2NH2SiO2OSi(CH2)3NH(CH2)2NH2(1)(OH)2H3CSO2Cl(OTs)2(2)n(OTs)OSiO2H2NRn(NHR)OSiO21.5 刷型手性固定相 ?刷型手性固定相（CSP）是通过链烃基将手性有机小分子链接到硅胶载体上制得，又叫 Pirkle型手性固定相 ?刷型手性固定相的合成主要有两种途径，即含端羧基或异氰酸酯基的手性基团的化合物与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含酰胺型或脲型结构的手性固定相： OOOOOOSi(CH2)nNH2+R*COOHSi(CH2)nNH2+R*HNCOOOOOOOSi(CH2)nNHCOR*Si(CH2)nNHCONHR*连接到硅胶表面的手性有机物在手性中心附近至少含有一种下列的功能团： （1）酸性或碱性的芳香基团，在手性识别过程中能发生电荷转移 相互作用； （2）能形成氢键的原子或基团； （3）能发生偶极-偶极叠合相互作用的极性键或基团； （4）能提供立体排斥，范德华相互作用构型控制的非极性基团。

?交互作用原理是对“刷型”手性固定相设计有重要指导意义的原则，即如果一个固定性的化合物A的对映体之一能对另一化合物B的对映体进行拆分的话，那么反之亦然 ?刷型手性固定相有较好的色谱效能和对映体的识别能力，在高压下稳定性好，但是这类固定相一般只能在正相条件下使用，限制了它的应用范围 1.6 蛋白质型CSPs ?这类CSPs是利用蛋白质中的氨基或羧基将蛋白质键合到经修饰的硅胶上，修饰硅胶的官能团可以是环氧基、氨基或醛基等 ?蛋白质型CSPs主要用于生物医学分析，表现出的对映体选择性较强，但对 pH值、有机调节剂的含量变化十分敏感 ?此类CSPs还有几个显著的缺点：负载量低， ?进样量大于lμg就可观察到过载现象；对周围环境过于敏感，0.1单位的pH值变化就可 ?能导致容量因子20％的变化；稳定性差，必须使用预柱提高寿命；结构选择性差，很容易受干扰 1.7其它类CSPs ?1.配体交换类CSPs ?当配体给出的电子能够进入过渡金属空的 d轨道，就能形成金属配位络合物这种配位络合物具有非常明确的几何形状，配体在空间只能占据某种给定的位置，配体交换手性色谱分离的机理就是基于此。

?它一般是将氨基酸固定在载体上，在流动相中使用二价金属阳离子，当样品进入时，在键合氨基酸、二价金属阳离子和被拆分的对映体之间形成三元络合物，利用它们之间的热力学稳定性的不同进行拆分 ?2.冠醚类CSPs ?手性识别主要基于固定相“空穴”的主－客体络合和氢键作用冠醚主体一般是取代联萘衍生物，联萘基团是手性选择体，能够通过与芳香胺以氢键或π-π作用形成络合物含有较大取代基的冠醚有较好的手性识别能力 ?主要用于分离胺、氨基酸及其衍生物的对映体 ?3.分子烙印聚合物类CSPs ?分子烙印聚合物的制备，常用的方法是烙印分子与具有某种官能团的单体混合，单体在交联剂的作用下共聚,产生高度交联、刚性的共聚物把烙印分子从聚合物中移去，在聚合物上留下与烙印分子在形状和官能团位置有互补性的识别点 ?4.合成高分子化合物类CSPs ?合成的旋光性高分子分为主链旋光和侧链旋光两种类型旋光性高分子的合成方法一般有： ?（1）旋光性单体的聚合，或用不同的单体共聚； ?（2）将不对称中心引入到非旋光性聚合物的侧链上； ?（3）非手性单体在专一的手性引发剂作用下聚合 这类CSPs一般是将低分子量的聚合物涂敷在大孔硅胶上，手性仅仅来自于它的稳定的单向螺旋结构，而这种螺旋结构产生于大体积酯基的立体排斥作用。

?其它类型的旋光性聚合物 CSPs还包含旋光性聚酰胺、聚氨酯类、含有轴手性联萘基的旋光性聚合物、(+)-聚-N-二苯甲基马来酰亚胺等 2.手性拆分实例 ?2.1 高效液相色谱手性固定相法分离酸性化合物对 映体 ?手性柱 涂敷型CDMPC(20 nm, 300 mm ×4.0 mm) Pirkl(S,S)WhelkO1(12mm,250mm ×4.0mm ) 样 品 西替立嗪 萘普生 托品酸 布洛芬 酮洛芬 2,2-二苯环丙烷羧酸 各种待分析酸性手性样品用乙醇配成合适浓 度,经0.2 mm微孔膜过滤.将醇和正己烷配 成所需比例,经0.5 mm微孔膜过滤并超声 涂敷型CDMPC柱上的分离 ?改变流动相正己烷中异丙醇的浓度(含0.1%三氟乙酸)对这6种酸性化合物进行手性分离 ?随着异丙醇含量的减少,流动相的极性减弱,对映体在CDMPC上的保留逐渐增强,分离度逐渐增大;但分离因子基本不变,说明流动相极性的改变不影响手性固定相识别的实质 ?除托品酸和酮洛芬外,其它溶质都获得了基线分离。

?CDMPC上手性识别主要取决于溶质的结构,包括大小、形状和环的数目 ?西替立嗪在固定相上的保留最强,获得了最好的分离;而托品酸保留虽强,却只获得部分分离,说明溶质保留的强弱并不是手性识别的关键因素,可能溶质在固定相手性空腔中的包容作用以及溶质体积大小和立体结构对其适应性才是关键 (S,S)-Whelk-O1上的分离 ?改变正己烷中异丙醇的浓度(含0.1%乙酸),对上述6种酸性化合物进行对映体分离 ?异丙醇浓度变化对分离的影响趋势与CDMPC的基本一致 ?托品酸在该柱上也只获得了部分分离,主要原因可能是托品酸与萘普生、酮洛芬、布洛芬的结构有明显差别,尤其是其手性碳上的取代基团含有羟基 ?布洛芬、酮洛芬与萘普生结构相似,同属于2-芳基丙酸,在该柱上分离都优于CDMPC,只是酮洛芬的保留比布洛芬大得多,这可能是因为酮洛芬的芳基上多了一个苯基和羰基,使得其与固定相之间的π-π作用、氢键作用增强 ?决定溶质保留和发生手性识别的关键是溶质与固定相之间的吸引作用,主要是氢键作用和π-π作用 不同极性的醇类添加剂对手性分离的影响 ?乙醇、异丙醇和叔丁醇它们形成氢键的能力依次增强,分子体积也依次增大。

在流动相中分别添加这3种醇对布洛芬和酮洛芬进行手性分离 ?异丙醇作添加剂时,溶质的保留最强,分离最好,很可能是因为不同的醇分子体积大小不同 ,对溶质与CDMPC之间氢键作用的竞争能力不同 ,对手性空腔的手性环境改变也不同 ,其中异丙醇使得溶质与之最适应 ?对于布洛芬,叔丁醇作添加剂时比乙醇保留弱 ,分离度大,但对于酮洛芬,情况恰恰相反,说明醇的影响还与溶质体积大小和空间结构有关 ?Whelk-O1是Pirkle型小分子手性固定相 ,不存在手性空腔,与溶质之间主要是通过吸引作用发生手性识别 ?乙醇作添加剂时溶质保留弱 ,因为乙醇极性大,洗脱能力强,但同时醇的立体效应的变化也起一定的作用 ,故叔丁醇作添加剂时溶质保留反而比异丙醇强 ?从乙醇、异丙醇到叔丁醇 ,溶质的分离因子和分离度都逐渐增大,叔丁醇作添加剂是达到最好分离 ?醇对溶质保留和分离度的影响除了与溶质结构有关 ,还与醇本身形成氢键能力、极性、体积大小、空间立体结构以及浓度等因素有关 流动相中酸性添加剂对手性分离的影响 不加酸的流动相未能洗脱出对映体,而酸性添加剂的羧基与固定相以及溶质之间有两种氢键作用,还可能会影响固定相和溶质的空间结构,使得它们之间发生有效的选择性作用,从而增强了手性识别能  ?随着三氟乙酸浓度增加,流动相极性增大,酸与溶质对固定相CDMPC的非手性和手性作用点的竞争(尤其是氢键作用)逐渐加强,使得溶质保留逐渐减弱; ?若换成三氟乙酸,酮洛芬和布洛芬的保留增强,对分离因子都没有影响,但酮洛芬的分离变差,托品酸未获得分离。

?,对于不同的酸性溶质和固定相 ,要达到较好分离,所需的酸以及酸的浓度都不同 正电荷型纤维素衍生物手性固定相分离碱性化合物 ?手性柱 CSPI是由纤维素一2，3一二(3，5一二甲基苯基氨 基甲酸醋)一6一甲基丙烯酸酷)与带有二级胺的硅胶 共聚合而成，因而该固定相表面带有正电荷 CSPZ不含氨基，是非电荷型手性固定相. ?样 品 lPrenolol，metoprolol和propranolol， ?在相同的色谱流动相条件下，碱性手性化合物在CSPI上均得到了更好的分离，即具有更小的保留值和更大的选择性a值 ?对于非电荷型手性固定相CSPZ，这几种碱性化合物只有在碱性条件下才能获得分离:而在中性流动相条件下，保留非常强，很难被洗脱，色谱峰严重拖尾，同时还未能得到分离， ?碱性化合物上的氨基可以与固定相上残留的硅轻基发生静电相互吸引作用在碱性条件下，碱性化合物上氨基的解离受到了抑制(或部分抑制)，使得其分子形态接近于电中性，与固定相之间的静电吸引作用减弱，同时手性化合物可以较好地与非电荷型固定相进行手性识别，从而达到了较好的分离;在中性流动相条件下，碱性化合物与固定相之间的静电吸引作用力较强，因而手性化合物保留增强，拖尾严重。

?对于正电荷型手性固定相CSPI，由于其固定相表面含有二级胺，这些基团在中性或酸性流动相条件下可以带正电荷，这样就可以与碱性化合物产生静电排斥作用力，故在中性和酸性流动相条件下均可以较快出峰 ?碱性化合物在正电荷型手性固定相CSPI和非电荷型手性固定相CSPZ上的手性分离是不同的也就是说，在CSPI上由于静电排斥作用力的存在，使得碱性手性化合物可以在中性或酸性条件下进行分离，这样就可以避免碱性流动相条件对硅胶基质稳定性产生破坏这一缺点，可以延长手性色谱柱的使用寿命，优于传统的在碱性条件下分离碱性手性化合物的方法 。