浙江大学生物化学甲实验课件实验8植物基因组DNA的提取.ppt

植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取及及纯度与含量的测定纯度与含量的测定实验八实验八第一部分第一部分植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取一、实验目的和要求一、实验目的和要求1 1、学习并掌握植物基因组、学习并掌握植物基因组DNADNA的提取原理和方法；的提取原理和方法；2 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；3 3、学习并掌握对电泳检测基因组、学习并掌握对电泳检测基因组DNADNA结果的初步分析结果的初步分析二、实验基本原理二、实验基本原理 植物基因组DNA的提取方法就其提取原理主要有二种：十六烷基三乙基溴化铵（CTAB)法、十二烷基硫酸钠 (SDS)法十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物基因组 DNA溶液 由于植物中的次生代谢产物——多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。

传统的CTAB-DNACTAB-DNA提取法提取法步骤多，较烦琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率SDSSDS法法操作简单，温和,也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类杂质较多,这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性 本实验采用十二烷基硫酸钠 (SDS)法提取植物基因组DNA，基因组DNA提取后， ①通过琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳鉴定基因组DNA分子量大小、纯度；②用紫外吸收紫外吸收法测定法测定基因组DNA纯度与含量DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳鉴定鉴定: : DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，它在电场中向正极移动在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。

影响影响DNADNA泳动速率（迁移率）的因素有：泳动速率（迁移率）的因素有：⑴ DNADNA分子质量的影响：分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比分 子量越大，迁移率越小 ⑵ DNADNA构型的影响：构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA⑶ 胶浓度的影响：胶浓度的影响： 浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度 为1％～2％；⑷ 电场强度的影响：电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快但凝胶的有效分 离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm） （电场强度） 而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜进行 高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶⑸ EBEB的影响：的影响：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增 加⑹ 电泳缓冲液的影响电泳缓冲液的影响: :核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们 各有利弊TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环 TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应所以多采用 TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护 DNA缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动⑺ 碱基组成与电泳温度的影响碱基组成与电泳温度的影响: : 一般影响不大在在DNADNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：提取过程中必须始终注意以下几个关键问题：（1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件2）抑制内外源DNase的活力DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失3）防止化学降解如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜4）防止物理因素降解如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。

5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的三、实验材料与试剂三、实验材料与试剂1、实验材料：植物幼嫩叶子2、实验试剂（1）基因组DNA提取缓冲液（2）氯仿:异戊醇:乙醇抽提液（3）TE缓冲液（4）平衡酚：（5）RNA酶A（6）酚/氯仿（7）氯仿/异戊醇（8）异丙醇、无水乙醇、70%乙醇9） 3mol/L NaAc（10） 5×TBE缓冲液（11） 6×电泳上样缓冲液（12） 1.0%琼脂糖凝胶（13） EB（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.四、实验器材与仪器四、实验器材与仪器1、研体2、离心机、离心管（7ml）及离心管架；3、微量移液器：10ul、1000ul；4、恒温水浴箱65 ℃5、制冰机；6、冰箱； 7、恒温水浴箱 37℃；8、微波炉； 9、电泳仪及电泳槽；10、紫外检测仪五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤 置于预热到65℃的研体中，加少许石英砂；加入预热到65℃的核酸提取缓冲液3 3 ml称取植物幼嫩叶子0.5g迅速研成匀浆转移到7ml带盖离心管中65℃水浴保温40 min，其间经常轻柔摇动加入3 ml氯仿-异戊醇溶液轻柔颠倒混匀后，室温静置分层5 min离心12000rpm×5min上清液转移到干净7ml离心管中，记录体积，弃沉淀，* *①加入等体积异丙醇试剂，混和后静置20 min沉淀DNA4℃离心5,000g×3 min收集絮状沉淀加入3mlTE，65℃水浴中助溶15min，使之完全溶解加入等体积的平衡酚，轻柔颠倒混匀，室静置10min4℃离心12,000rpm×10min转移上清于新7ml离心管中，记录体积* *②加入等体积的酚∶氯仿，轻柔颠倒混匀，室温放置15min4℃离心（12,000rpm，5min）吸取上清转移到一新7ml离心管中，记录体积* *③加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温放置5min4℃离心（12,000rpm，10min）吸取上清转移到一新7ml离心管中，记录体积* *④加入1/10体积3mol/L NaAC和2×体积–20℃预冷的无水乙醇–20℃放置20 min * *⑤4℃离心（ 12,000rpm ，10min）收集沉淀* *⑥用70%乙醇洗涤沉淀，倾倒掉乙醇溶液，干燥，让酒精完全挥发用1ml TE 溶解沉淀，加入5μl RNase（5μg/μl），37℃ 保温10 min，即为植物基因组DNA溶液* *⑦凝胶电泳检测基因组DNA（分子量大小、纯度）说明：如果蛋白质和RNA未去除干净，重复酚，酚/氯仿，氯仿抽提步骤，继续用RNase 处理，乙醇沉淀和洗涤，重溶于TE中，直至基因组DNA纯度和质量符合要求。

一）（一） 植物基因组植物基因组DNADNA的提取的提取①② 紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量①②③④* *植物基因组植物基因组DNADNA的提取操作过程现象的提取操作过程现象⑤⑥⑦* *植物基因组植物基因组DNADNA的提取操作过程现象的提取操作过程现象1、制胶制胶（1％琼脂糖凝胶） 在胶模上架好梳子称取01g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml 0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2 2、加样、加样 取5ul纯化的DNA原溶液样品，与1ul 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量每加完一个样品要换枪头以防互相污染注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿3 3、电泳、电泳 加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。

当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）4 4、观察和拍照、观察和拍照 取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组（二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNADNA第二部分第二部分基因组基因组DNADNA纯度与含量的测定纯度与含量的测定一、实验目的和要求一、实验目的和要求1、学习紫外吸收法测定核酸基本原理和方法；2、学习并掌握紫外吸收法测定基因组DNA纯度与含量的方法二、实验基本原理二、实验基本原理 核酸——DNA和RNA所含碱基的苯环结构（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有紫外吸收的性质，它们在260nm处有最大的吸收峰因此，可以用260nm波长进行核酸含量的测定 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型而有差异 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02 当当ODOD260260＝＝1 1时，双链时，双链DNADNA含量约为含量约为50μg / ml50μg / ml              单链DNA含量约为37μg / ml                RNA含量约为40μg / ml              寡核苷酸含量约为30μg / ml（由于底物不同有差异）1 1、核酸样品、核酸样品DNADNA、、RNARNA含量的测定：含量的测定： 如用用1cm1cm光径光径石英比色皿石英比色皿，用 H2O稀释DNA或RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前DNA的含量： DNA（μg/μl）=50×OD260读数× DNA样品稀释倍数/1000 RNA（μg/μl）=40×OD260读数× RNA样品稀释倍数/1000 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用溴化乙锭法或其他方法进行估算。

 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定由于 DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处所以，一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算它们的比值来判断核酸样品的纯度2 2、核酸样品纯度判断的一般标准：、核酸样品纯度判断的一般标准：⑴ DNA纯度：OD260/OD280≈1.8，表示为纯的DNA； OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染⑵ RNA纯度：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0，表示为纯的RNA； OD260/OD280 ＜1.7时，表示有蛋白质或酚污染； OD260/OD280 ＞2.0时，表示可能有异硫氰酸残存⑶ OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量；同时也会影响酶切和PCR的效果。

三、实验材料与试剂三、实验材料与试剂1、实验材料 植物基因组DNA样品2、实验试剂⑴ ddH2O；⑵ TE缓冲液（pH 8.0）四、实验器材与仪器四、实验器材与仪器1、离心机、离心管（5ml）及离心管架；2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及枪头；3、紫外分光光度计；4、石英比色皿（0.5cm光径）或1cm光径的微量石英比色皿（50ul、100ul）五、实验操作方法和步骤五、实验操作方法和步骤 方法方法1 1：： 将提取的植物基因组DNA样品吸取20ul，加到新的5ml离心管中，再加一定量的ddH2O 或TE缓冲液（pH 8.0）稀释100倍，用用0.5cm0.5cm光径石英比色皿光径石英比色皿（约需1.6ml样品溶液）或微量石英比色皿微量石英比色皿在紫外分光光度计上测定230nm、260nm、280nm处的吸光度计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度 方法方法2 2：： 直接取植物基因组DNA样品微量原液（1～2ul)，用分光光度计进行自动测定出230nm、260nm、280nm处的吸光度值，计算植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量以及DNA样品的纯度。

⑴ 用TE调0（空白）：⑵ 取植物基因组DNA样品原液1～2ul，进行自动测定230nm、260nm、280nm处的吸光度值：六、计算六、计算1、植物基因组DNA样品溶液的DNA的含量： DNA（μg/μl ）= 50×OD260读数×2 2* *×DNA样品稀释倍数/1000 （* 用用0.5cm0.5cm光径石英比色皿光径石英比色皿×2 2 ，用，用1cm1cm光径石英比色皿光径石英比色皿×1 12、植物基因组DNA样品溶液的DNA的纯度： OD260/OD280＝ OD230/OD260＝ 3、样品纯度判断： ⑴ OD260/OD280 ≈1.8，表示为纯的DNA； ⑵ OD260/OD280 ＞1.9，表示有RNA污染； ⑶ OD260/OD280 ＜1.6，表示有蛋白质、酚等污染七、结果分析讨论七、结果分析讨论下下 次次 实实 验验 课课自主设计实验与实践自主设计实验与实践 ——开题报告开题报告递交：递交：《《自主设计实验与实践课题申请书自主设计实验与实践课题申请书》》 及及“实验药品、器材和仪器需量申领表实验药品、器材和仪器需量申领表”。