分光光度计测核酸蛋白时A260A280 和 A260A230 的含义以及注意的问题.docx

分光光度计测核酸蛋白时A260/A280和A260/A230的含义（一）1、 A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为 0.1至1.0如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内； 如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确， 样品内有 悬浮物等）影响DNA样品的A260吸光度值是 否〉0.1请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的 干扰通常会对光有一定吸收，其值＜0.1）2、 A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进 行核酸样品纯度评估：纯 DNA的A260/A280比值为1.8，纯 RNA为2.0如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质 的污染，需要纯化 样品比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶 液3、 A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核 酸样品纯度 评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5 若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶 剂污染，需要纯化 样品A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。

在下一个测定中， 需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正4、 A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子 该值应该接近0.0如果 不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化 样品纯样品的A320 一般是05、 A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值，纯度好的 DNA, 在 pH7-8.5 下其比值应该在 2.0 或 2.5, A260 / A280 的 比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm纯 净的样品比值大于1.8（DNA）或 者2.0（RNA）如果比值低于 1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者 酚类物质的影响A230是 多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样 品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的 核酸 A260/A230的比值大于2.06、 A280是蛋白质的吸光度纯净的DNA和RNA在A260和 A280都有吸收值，但以260最高而核酸提取过程中最主要的 污染物蛋白质在A280处有强烈的吸收值，所以计算这两个吸收 峰的比值就可以确定核酸的纯度DNA的这个值一般是1.8〜2.0， 而RNA则是2.0。

值得注意的是，这个比值并不能很好的反应出 核酸的纯度，简单来说寡聚核酸会造成A260值升高，如果核酸 有降解，则会导致A260/A280值上升另外，如果A280值偏高， 并不一定是蛋白污染蛋白在A280有吸 收值是因为其苯丙氨酸 等氨基酸残基中所含有的苯环的缘故，所有含苯环的化合物都会 在A280有吸收峰所以如果A280升高虽然有最有可能是蛋 白污染，但也有可能是其他苯环物质如植物DNA提取过程中 的多酚类物质污染另外，如果要求高的话，我们还会要求测量 A230的值，正常情况下，核酸的A260/A230和A260/A280是一致的，如果这个值上升则样品可能会含有多糖类的污染二）A280nm, A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核 酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA 为2.0如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染， 需要纯化样品比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液.酚的最 大吸收峰在270nmA230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸 样品纯度评估：DNA和RNA的A260/A230纯比值为2.5若 比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污 染，需要纯化样品。

A230产生负值主要是由于在很低DNA浓 度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的在下一个测 定中， 需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子该 值应该接近0.0如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要 纯化样 品纯样品的A320 一般是0A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值 纯度好的 DNA 或 RNA，pH7-8.5下 A260 / A280的比值应该在2.0或 2.5在纯净的样品比值大于1.8 （DNA）或者2.0 （RNA）如果 比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或 者酚类物质的影响A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等， 较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0当0.5%BSA蛋 白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结 果是260/280比值下降，260/280的比值变化并不显著，但正 如分子克隆3所说但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显 著影响260/230的比值也就是说，如果RNA样品的260/280 = 1.7, 260 /230=0.5，那么就应该考 虑污染原因不是胍盐残留，而 是蛋白残留.酚的最大吸收峰在270。

酚的残留会显著的增加230、 260和280的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最 大吸收峰向270方向偏移，也就是说最大吸收峰在270附近也 就是说，如果RNA如果 样品的260/280=1〜1.5, 260/230=1〜1.5, 那么污染原因就应该考虑是酚残留那么污染原因就应该考虑是 酚残留胍盐对RNA样品吸收有显著影响，会在小于230nm处 产生大的吸收峰胍盐残留不会影响 260和280的数值，对 260/280的比值不会造成大的影响，当然也不影响RNA定量但 胍盐残留对260/230比值具有明显影响例如本例中260/230 的比值小于0.21时，260/280的比值还>2也就是说，如果RNA 如果 样品的260/280>=2，260/230<1，那么污染原因就应该考虑 是胍盐残留，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留其他：用分 光光度计测量RNA时，用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样 品会造成A260/A280比值下降原因是低离子强度和低pH溶 液会增加280 nm处的光吸收值那样就很容易被蛋白污染，加 氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污 染 所以现在一般取400ul左右。

当260/230<1时，只有两种情况一是胍盐污染，二是蛋白污染。