DNA体外重组技术PPT课件.ppt

第五章第五章基因工程基本基因工程基本技术技术概述概述一、一、DNA重组技术相关概念重组技术相关概念 克隆克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、菌、细胞或胞或动物（常被成物（常被成为副本或拷副本或拷贝）克隆化克隆化(cloning)获取大量取大量单一拷一拷贝的的过程，也称程，也称无性无性繁殖繁殖DNA克隆克隆(DNA cloning)应用用酶学学的的方方法法，，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗传物物质（（DNA））与与载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子（（复复制制子子)-重重组DNA 继而而通通过转化化或或转染染宿宿主主细胞胞，，筛选出出含有目的基因的含有目的基因的转化子化子细胞再再进行行扩增增提提取取获得得大大量量同同一一DNA分分子子的的过程程称称为DNA克克隆隆，，又又称称为基基因因克克隆隆(gene cloning)或或 分分 子子 克克 隆隆 (molecular cloning)  ※ “克隆克隆”某一基因或某一基因或DNA片段片段过程程中，将外源中，将外源DNA插入插入载体分子所形成的复体分子所形成的复制子是制子是杂合分子－嵌合合分子－嵌合DNA，所以，所以DNA克克隆隆又称又称重重组DNA (recombinant DNA)。

※实现DNA克隆所用的方法及相关的克隆所用的方法及相关的工作称工作称DNA重重组技技术(recombinant DNA technology)，又称，又称基因工程基因工程(genetic engineering) ※基因工程目的：基因工程目的：①① 分离分离获得某一感得某一感兴趣的基因或趣的基因或DNA ②② 获得感得感兴趣基因的表达趣基因的表达产物（蛋白物（蛋白质））二、二、DNA重组技术基本程序重组技术基本程序外源外源DNA的获取的获取连接物连接物（（重组重组DNA)导入合适导入合适受体细胞受体细胞目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 分、切、接、转、筛第一节DNA体外重组载体的种类与选择体外重组载体的种类与选择载体载体（（vector）：）：能携能携带外源基因外源基因进入受入受体体细胞胞, 并在其中并在其中进行行扩增或增或诱导外源基外源基因表达的工具因表达的工具* 作为基因工程载体所需具备的作为基因工程载体所需具备的基本条件基本条件：：1. 带有带有复制子复制子，能在宿主细胞内携带外源基因，能在宿主细胞内携带外源基因一同进行复制。

一同进行复制 3. 具有多个具有多个筛选标志：筛选标志：如抗药基因、营养缺陷如抗药基因、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应等型、噬菌斑形成及显色反应等2. 有单酶切位点有单酶切位点、多克隆酶切位点、多克隆酶切位点(多种酶单多种酶单一位点一位点)，供外源基因的插入供外源基因的插入 4. 表达型载体还应有使外源基因表达的完整表达型载体还应有使外源基因表达的完整的转录单位：如的转录单位：如强启动子、前导序列、增强启动子、前导序列、增强子强子等等调控元件调控元件（一）按功能分类（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类（三）按载体来源分类一、载体的一、载体的分类分类克隆型载体克隆型载体表达型载体表达型载体原核细胞载体原核细胞载体真核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）（穿梭载体）原核克隆型载体原核克隆型载体原核表达型载体原核表达型载体真核转递型载体真核转递型载体真核表达型载体真核表达型载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体粘性载体粘性载体 细菌培养细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义定义: 是存在于细菌是存在于细菌染色体外染色体外的的能独立复制能独立复制的的双链闭环双链闭环的的DNA分子，是能赋予细菌某些特性分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。

的辅助性遗传单位二、不同载体的特点与分类二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体（一）质粒载体1. 质粒质粒(plasmid)的特征的特征1. 质粒的特征质粒的特征•功能：功能： 使宿主细胞具有抵抗不利自身生使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力长因素的能力•性质：性质：具有不相容性具有不相容性•按拷贝数分类：按拷贝数分类： 严谨性（低拷贝）严谨性（低拷贝） 松弛型（高拷贝）松弛型（高拷贝）克隆用质粒载体应具备的特点：克隆用质粒载体应具备的特点：•分子相对较小，具有较高的拷贝数分子相对较小，具有较高的拷贝数•含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加•具有多种遗传选择标记，包括各种具有多种遗传选择标记，包括各种抗药抗药基因或营养代谢基因基因或营养代谢基因等2. 质粒载体的分类质粒载体的分类: 克隆载体和表达载体克隆载体和表达载体（（1）克隆用质粒）克隆用质粒抗药基因或营养代谢基因抗药基因或营养代谢基因•氨苄青霉素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因（ampr））:编码编码β-内酰胺酶，水解内酰胺酶，水解amp β-内酰胺环使内酰胺环使amp失效失效•四环素抗性基因（四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵）：编码转膜泵将将tet从细胞移出从细胞移出•大肠杆菌大肠杆菌LacZ基因基因：编码半乳糖苷酶，：编码半乳糖苷酶，分解分解X-gal，使菌落变为，使菌落变为蓝色蓝色。

*lac Z N端端146 aa残基编码基因残基编码基因*lac Z编码产物为编码产物为β半乳糖苷酶半乳糖苷酶α片段片段（（N端）端）,突变型突变型lac –E. coli可表达该酶的可表达该酶的ωω片段片段（（C端端)，两片段单独存在无活性，两片段单独存在无活性 *两端同时存在时有活性两端同时存在时有活性-----蓝色化合物蓝色化合物 α互补（互补（ α complementation））*在在Lac Z 基因内无外源基因内无外源DNA的插入，在含的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现的培养基上生长时会出现蓝色菌落蓝色菌落---阴性克隆阴性克隆 *在在Lac Z 基因内插入外源基因内插入外源DNA,在含在含X-gal的培的培养基上生长时会出现养基上生长时会出现白色菌落白色菌落---阳阳性克隆性克隆 X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因基因α互补筛选互补筛选-蓝白斑筛选蓝白斑筛选外源外源DNA插入插入白色白色IPTG诱导诱导异丙基异丙基-β-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类为半乳糖的类似物似物α互互补筛选法法-（（2’37’’））阴性克隆阳性克隆AmprORITetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：：复制起始点，复制起始点，保证高拷贝保证高拷贝自我复制自我复制。

结构：结构：Ampr, Tetr：：两个抗性基因用于两个抗性基因用于筛选筛选阳性克隆阳性克隆Pst I, BamH I：：两个单酶切位点两个单酶切位点用于插入用于插入目的基目的基因因AmprLacZMCSpfxBlue: 克隆质粒MCS：：Multiple Cloning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)OriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCS*pUC18/pUC19的的MCS方向方向相反相反pMD-18 T simple克隆载体的结构克隆载体的结构 2. 质粒载体的分类质粒载体的分类:（（2）表达用质粒载体：）表达用质粒载体：•除具备载体的必备条件外还应有用于除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终外源基因表达的元件：如启动子、终止子等止子等•分类：分类： 原核表达载体原核表达载体 真核表达载体真核表达载体pET-32a(+)原核表达载体的结构原核表达载体的结构 *pET系列的基本结构：系列的基本结构：T7启动子、启动子、MCS、、T7终止子、终止子、Ampr等等Amprlac*可将可将T7 RNA聚合聚合酶基因置于酶基因置于lac启动启动子的控制下子的控制下pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子 驱动目的基因在真核真核细胞细胞内表达BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾尾，使其更稳定稳定。

（二）（二）  噬菌体噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos末端末端 cos 末端末端ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型  噬菌体作为载体具有两个特点噬菌体作为载体具有两个特点 ①①  噬菌体生长繁殖所噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其必需的序列位于其左右二臂左右二臂上，噬菌体基因组中央含有上，噬菌体基因组中央含有30%的的DNA是是 噬菌体生长所非必需的噬菌体生长所非必需的 ②②  噬菌体的成熟需要噬菌体的成熟需要包装包装，当与外源，当与外源DNA重组后的大小介于原来的重组后的大小介于原来的75%～～105%之间时，重组的之间时，重组的DNA分子才可包分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒装为成熟的噬菌体颗粒  噬菌体的种类：噬菌体的种类：Charon系列、系列、  gt系列、系列、EMBL系列系列（三）粘粒载体（（三）粘粒载体（cosmid)•质粒序列：质粒序列：复制原点，抗性标志复制原点，抗性标志•噬菌体：噬菌体：cos粘端序列粘端序列 插入片段插入片段长度长度可以是载体本身长度可以是载体本身长度的的7-10倍倍（四）（四） 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(YAC)质粒质粒pBR322衍生物衍生物酵母基染色体酵母基染色体中心粒中心粒端粒端粒复制起点顺序复制起点顺序复制起点复制起点(ori)Ampr基因基因组成组成用途用途构建真核生物基因组构建真核生物基因组DNA文库文库能携带更大（能携带更大（1Mb）的插入片段）的插入片段第二节第二节基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，，RE) 是是能能够够识识别别和和切切割割双双链链DNA内内部部特特定核苷酸序列定核苷酸序列的一类核酸酶。

的一类核酸酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HⅠØ定义：定义：切切——基因工程的基因工程的手术刀手术刀Ⅰ、、Ⅱ、、Ⅲ（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用Ⅱ型）型） 切切——基因工程的基因工程的手手术刀刀Ø分类：分类：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶Ø命名：命名：Hin dⅢ 属属 种种 株株 序序Haemophilus influenza d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶ⅡⅡ类酶识别序列特点类酶识别序列特点 识别顺序识别顺序一般为一般为4～～6个碱基个碱基，通，通常为常为回文回文结构结构(palindrome)(核苷酸序列呈二元旋转对称核苷酸序列呈二元旋转对称,180°反反向重复向重复））切口切口 ：：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口平头或钝性末端平头或钝性末端（（blunt end) 粘性末端粘性末端（（sticky end) 产生生5  突出黏性末端突出黏性末端 (sticky end)EcoR I**********GAATTC******************CTTAAG********5′5′3′3′5′5′3′3′*********G*********C T T A A 5′5′3′3′3′3′5′5′—OH—P A A T T C********* G*********5′5′3′3′3′3′5′5′P OH— 产生生3  突出黏性末端突出黏性末端Pst I**********CTGCAG************************GACGTC**************5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′3′3′5′5′—OH—P*********C T G C A*********G5′5′3′3′3′3′5′5′OH——PA C G T C**********************G**********************酶单位定义：酶单位定义： 在适当反应条件下，在适当反应条件下，1h内在内在50μl体体系中完全酶解系中完全酶解1μg特定特定DNA底物所需酶底物所需酶量，定为量，定为1个活性单位。

个活性单位 出售的内切酶几乎均以出售的内切酶几乎均以λ噬菌体噬菌体DNA作底物测其酶活性单位作底物测其酶活性单位酶切鉴定酶切鉴定 ：：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、二、DNA聚合酶聚合酶含含3种酶活性：种酶活性：1. 大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I•5′→ 3′聚合酶活性聚合酶活性• 3′→ 5′外切酶活性外切酶活性• 5′→ 3′外切酶活性外切酶活性•催化催化DNA缺口平移反缺口平移反应,制制备DNA探探针(5′→ 3′外切外切酶活性活性)-----主要用途主要用途•DNA序列分析序列分析应用：应用：二、二、DNA聚合酶聚合酶2. Klenow片段片段•随机引物随机引物标记法法标记探探针---主要用主要用途途•双脱氧末端双脱氧末端终止法止法进行行DNA测序序•cDNA第二第二链的合成的合成•DNA 3′突出末端突出末端进行末端行末端标记用途：用途：(大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶I大片段，大片段， 缺缺5′→ 3′外切外切酶活性活性) #38. 323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5    核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸   5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶活性聚合酶活性 N 端端C 端端枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶DNA-pol Ⅰ Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行分子，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

生物学研究中常用的工具酶 二、二、DNA聚合酶聚合酶•PCR反反应---主要用途主要用途•DNA测序序用途：用途：3. Taq DNA聚合聚合酶(65kD)耐热，耐热， 在在70～～75℃时具有最佳的生时具有最佳的生物活性，物活性， 无无3′→ 5′外切酶活性外切酶活性(无无校正功能校正功能）） #40. 3´5´外切酶活性的功能外切酶活性的功能校读（校读（proofread）功能）功能17/62将错配的核苷酸从引物链的将错配的核苷酸从引物链的3′端端除去除去  （（1））反转录活性：反转录活性：即以即以RNA为模板合成为模板合成DNA(主）主） （（2））RNase H活性：活性：水解水解RNA-DNA中的杂合中的杂合 分子中的分子中的RNA（（3））DNA-pol活性：活性：以以DNA为模板合成为模板合成DNA 4. 反转录酶反转录酶(Reverse Transcriptase, RT)二、二、DNA聚合酶聚合酶反转录病毒细胞内的逆转录过程反转录病毒细胞内的逆转录过程RNA 模板模板反转录活性反转录活性DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNase H活性活性单链单链DNADNA-pol活性活性双链双链DNA三、三、DNA连接酶连接酶(DNA ligase) ——基因工程的基因工程的缝纫针缝纫针 *催化双链催化双链DNA相邻碱基相邻碱基5′-P和和3′-OH间间磷酸二酯键磷酸二酯键形成的酶。

形成的酶T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶----最常用最常用 ①①催化两个独立催化两个独立DNA片段片段(粘性末端和平末端粘性末端和平末端) 5′-P和和3′-OH之间形成之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键主要功能与用途：主要功能与用途：催化催化平末端平末端连接要比连接要比粘性末端粘性末端 效率低得多效率低得多②②修复双链修复双链DNA分子中单链缺口分子中单链缺口四、其他修饰酶四、其他修饰酶功能：功能： 催化多个催化多个脱氧脱氧核苷酸核苷酸依次加到依次加到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3′-OH末端一一) 末端末端脱氧核苷酸脱氧核苷酸转移酶转移酶(TdT) 用途：用途： 1. 主要作用是在载体或目的基因主要作用是在载体或目的基因 3′末末端加上同源端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工粘性人工粘性末端末端，便于，便于DNA重组2. DNA 3′末端的末端的同位素标记同位素标记催化催化DNA、、RNA以及核糖和脱氧核以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的糖三磷酸上的 5′ 磷酸基团水解磷酸基团水解用途：用途：1. 在连接反应中去除载体在连接反应中去除载体DNA片段片段5′-P，防止载，防止载体自我连接体自我连接.2. 用用32P标记标记5′末端时，用此酶去除末端时，用此酶去除5′-P，再用，再用激酶进行激酶进行5′的的 32P标记标记.(二二) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶功能：功能：(三三) 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶(四四) RNase(五五) DNase第三节第三节目的基因的获得和修饰目的基因的获得和修饰------分分一、采用限制性内切酶酶切法直接分采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因离目的基因1.从原核基因组中制备从原核基因组中制备2.从真核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用采用PCR或或RT-PCR方法制备目的方法制备目的基因基因1.获得已知的基因获得已知的基因2.构建构建RT-PCR文库法并获得未知基因文库法并获得未知基因3.计算机克隆计算机克隆三、基因组文库或基因组文库或cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选基因组文库基因组文库(genomic library，，G文库文库)：： 将基因组将基因组DNA用内切酶消化后插入到适当用内切酶消化后插入到适当载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，载体中，得到含有不同插入片段的克隆载体，再将其导入适当的宿主细胞，再将其导入适当的宿主细胞， 宿主细胞宿主细胞中克隆中克隆载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库。

载体含有不同的基因组片段，称为基因组文库G文库构建方法文库构建方法：：鸟枪法鸟枪法分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：分子杂交及：分子杂交及探针技术探针技术组织或或细胞染色体胞染色体DNA基因片断基因片断克隆克隆载体体重重组DNA分子分子含重含重组分子的分子的转化菌化菌限制性内切限制性内切酶受体菌受体菌Ø从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因 cDNA文库文库(cDNA library，，C文库文库)：： 将细胞内所有将细胞内所有mRNA 逆转录为逆转录为cDNA，再，再将所有将所有cDNA片段克隆到适当的载体中片段克隆到适当的载体中 ，，并将并将其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中其导入适当的宿主细胞，宿主细胞中含有不同含有不同cDNA片段的克隆载体混合物就是片段的克隆载体混合物就是C文库文库C文库构建方法文库构建方法：： 反转录法合成的反转录法合成的cDNA与合适的载与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的体重组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：：分子杂交及探分子杂交及探针技术针技术mRNA cDNA 双双链cDNA 重重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反反转录酶 载体体 受体菌受体菌 复制复制Ø 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 *由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。

序列四、化学合成法制备基因片段四、化学合成法制备基因片段*已知序列用已知序列用DNA合成仪合成仪 本方法适用于氨基酸残基数目较少的本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因蛋白基因缺点：缺点： 2. 如目的基因如目的基因DNA序列需序列需通过氨基酸序通过氨基酸序 列推测列推测，难于保证与，难于保证与天然基因天然基因序列一序列一 致，往往导致致，往往导致表达效率大大降低表达效率大大降低 1. 只能合成较小片段的只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段四、化学合成法制备基因片段第四节第四节目的基因的载体连接目的基因的载体连接----接，分子克隆的核心接，分子克隆的核心一、一、PCR产物的克隆策略产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法（一）限制性内切酶酶切位点添加法*利用目的片段所特有的限制性内切利用目的片段所特有的限制性内切酶识别位点对产物进行酶切分析酶识别位点对产物进行酶切分析在设计在设计PCR引物时要考虑到连接方引物时要考虑到连接方式，直接在引物的末端包含与载体式，直接在引物的末端包含与载体相匹配的限制性内切酶位点相匹配的限制性内切酶位点。

(二）二）T/A克隆法克隆法 *PCR产物的产物的3′末端加一个末端加一个A的粘性端，的粘性端，将其直接克隆至将其直接克隆至3′粘性末端含一个粘性末端含一个T的的线性克隆载体中线性克隆载体中3′5′T载体体3′5′载体体T3′5′3′5′AAPCR产物物一、一、PCR产物的克隆策略产物的克隆策略TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR扩增扩增+3′3′5′PCR产物物AA5′T载体体TT5′5′3′3′连接接转化化蓝白白筛选校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR产物产物Taq酶酶dATP*不需酶切不需酶切*不受酶切不受酶切位点的限制位点的限制（一）粘性末端连接法（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插适用于插入片段和入片段和载体具有载体具有相同相同的粘的粘性末端性末端高背景高背景(自身环自身环化化)双向双向(正、反正、反)插插入入单酶切切缺陷缺陷二、外源二、外源DNA片段和载体的连接片段和载体的连接#58. Bam HⅠ切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶16ºC 16 hGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam HⅠⅠ切割切割载体载体DNA用用Bam HⅠ切割切割重组体重组体目的基因目的基因自连自连载体载体自连自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接如何实现？如何实现？（二）平头末端连接法（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（三）人工接头法（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因++DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和本法适用于在质粒和目的基因上目的基因上没有相同没有相同的的酶切位点酶切位点由平端加上新的酶切位点，再用限制酶由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端而进行粘端连接切除产生粘性末端而进行粘端连接。

（四）同聚物接尾法（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点第五节第五节重组分子的扩增和鉴定重组分子的扩增和鉴定一、重组一、重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞----转转宿主细胞或受体细胞：宿主细胞或受体细胞：•定义定义：被导入重组：被导入重组DNA分子的细胞分子的细胞•分类：分类： 原核细胞：原核细胞：大肠杆菌大肠杆菌、链霉菌、链霉菌 及枯草杆菌及枯草杆菌 真核细胞：真核细胞：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞•要求：要求： ※容易接纳重组容易接纳重组DNA分子分子 ※对载体的复制扩增无严格限制对载体的复制扩增无严格限制 ※不存在特异的能降解外源不存在特异的能降解外源DNA的内切酶的内切酶 ※不对外源不对外源DNA进行修饰进行修饰重组重组DNA分子导入方式：分子导入方式：•转化转化(transformation) 将重组将重组DNA分子导入分子导入原核细胞原核细胞的过程。

的过程•转染（转染（transfection)　　将重组　　将重组DNA分子导入分子导入真核细胞真核细胞的过程•感染（感染（infection））　　以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重　　以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组组DNA，经，经体外包装体外包装成具有成具有感染性感染性的噬菌体的噬菌体或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白或病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组将重组DNA注入原核或真核细胞，使目的基注入原核或真核细胞，使目的基因得以繁殖的过程因得以繁殖的过程转化转化(transformation)•转化的关键转化的关键：感受态细胞的制备：感受态细胞的制备•感受态细胞（感受态细胞（competent cell））：：经理经理化方法处理而容易接收外源化方法处理而容易接收外源DNA分子分子的细胞•转化的方法：转化的方法：　化学法（　化学法（ CaCl2 法法）：需感受态细胞：需感受态细胞　电穿孔法：不需感受态细胞　电穿孔法：不需感受态细胞　　　　　　转化效率较高　　　　　　转化效率较高　　　　　　但需特殊仪器　　　　　　但需特殊仪器基因基因导入装置入装置(Bio-Rad)BTX ECM 2001多功多功能细胞融合仪能细胞融合仪 　　　　　转染（转染（transfection) 　　　　分类：分类：瞬时转染瞬时转染 稳定转染：稳定转染：G418（（Geneticin)方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔法电穿孔法 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 非非转化子化子转化子化子非重非重组体体重重组体体鉴定定单抗生素抗生素筛选非非转化子化子( (不能生不能生长））转化子化子阳性重阳性重组体体自身自身环化化载体体未未酶解完全解完全载体体非目的基因插入非目的基因插入载体体二、重组二、重组DNA分子的筛选、鉴定分子的筛选、鉴定（一）抗生素筛选（一）抗生素筛选仅作为初步筛选仅作为初步筛选AmprTetr插入失活的双抗生素对照筛选法*若目的基因插入抗若目的基因插入抗生素抗性基因生素抗性基因外部外部，，重组质粒重组质粒能能在含该抗在含该抗生素的培养基上生长生素的培养基上生长*若目的基因插入若目的基因插入抗生素抗性基因抗生素抗性基因内内部部，即引起，即引起插入失插入失活活，重组质粒，重组质粒不能不能在含该抗生素的培在含该抗生素的培养基上生长养基上生长BamH IDNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPst I目的基因与目的基因与pBR322经经BamH I酶切后进行重组酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？如何筛选得到阳性克隆？思考题思考题用BamH I酶切( (插插入入失失活活法法) ) 抗抗药药性性标标记记选选择择在在tetr（（TcR)中插入外源中插入外源DNAampr插入失活的双抗生素对照筛选法克隆克隆3,5,7,9,10 是是阳性克隆阳性克隆TetTet平板平板123456789101112123456789101112AmpAmp转化子转化子非转化子非转化子(不能生长不能生长)插入失活筛选法插入失活筛选法(1’20’’)(三）酶切电泳鉴定三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶限制性内切酶酶切鉴定酶切鉴定快速小量提取质粒快速小量提取质粒DNA跑得跑得慢慢--重组质重组质粒粒跑得跑得快快--空载体空载体（二）（二）X-gal筛选筛选---蓝蓝/白白筛选筛选 见于见于pUC系列、系列、 pEGM系列、系列、M13蓝色菌落：阴性克隆蓝色菌落：阴性克隆 白色菌落：阳性克隆白色菌落：阳性克隆 #75  α互互补补利用利用α互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 重组重组CK2β 亚基转化子的筛选亚基转化子的筛选 第第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆号克隆是阳性克隆; 第第4,6,8号是阴性克隆号是阴性克隆1. λDNA/EcoR I+Hind Ⅲ 2. recombinant plasmid /Nde I+Hind III3. recombinant plasmid /Hind III 4. pT7-7/ Hind III 重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定（四）序列分析（四）序列分析 *通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列通常采用多克隆酶切位点两端的载体序列作为测序时引物的结合位点作为测序时引物的结合位点---通用引物通用引物 *对于对于表达型表达型重组子，插入片段必须是正确重组子，插入片段必须是正确的序列，一般要进行的序列，一般要进行DNA测序测序ABI PRISM 310型型 DNA测序仪测序仪主要用于DNA序列分析PE 3700型型DNA测序仪测序仪（五）其他方法（五）其他方法内切酶内切酶重组重组DNA目的基因目的基因分离分离电泳电泳印迹到印迹到NC膜膜探针探针放射性放射性非放射性非放射性分子杂交分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜 裂解、 变性、固定等与探针杂交放射性自显影1 2 34 5 63 3和和5 5是阳性克隆是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交菌落印迹杂交菌落印迹杂交 (6’03’’)SDS-PAGE purified recombinant human CK2 β subunit and Western blot用已知的特异抗体检测目的基因蛋白免疫化学检测（免疫化学检测（Western blot)重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因文库基因文库 内切酶内切酶化学合成化学合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主鉴定鉴定（（酶切电泳、序列分析、杂交、酶切电泳、序列分析、杂交、Western blot等）等）筛选筛选 (抗生素、抗生素、X-gal 等法等法)阳性重阳性重组体体第六节第六节 外源基因的表达外源基因的表达表达体系的建立表达体系的建立: :表达表达载体的构建体的构建受体受体细胞的建立胞的建立表达表达产物的分离物的分离纯化化 外源基因的表达涉及目的基因外源基因的表达涉及目的基因的的克隆克隆、复制、、复制、转录、翻、翻译、蛋白、蛋白质产物的加工及分离物的加工及分离纯化等化等过程程 一、外源基因在原核系一、外源基因在原核系统中的表达中的表达 大大肠杆菌（）表达体系最常用杆菌（）表达体系最常用※表达表达载体：体：选择标志、多克隆位点志、多克隆位点￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿强启启动序列、翻序列、翻译调控序列控序列※优点：点： 培养方法培养方法简单、迅速、、迅速、经济而又适而又适合大合大规模生模生产。

原核表达系原核表达系统的不足的不足 •只适合表达克隆的只适合表达克隆的cDNA，，不宜表达真核不宜表达真核基因基因组DNA •表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行修行修饰 •真核蛋白常以无生物活性的真核蛋白常以无生物活性的包涵体形式包涵体形式存存在在 •难以以实现大量表达分泌性蛋白大量表达分泌性蛋白 •真核蛋白不真核蛋白不稳定，易被定，易被细菌蛋白菌蛋白酶降解降解 •原核原核细胞周胞周质中常含有种中常含有种类繁多的内毒素繁多的内毒素  真核表达系真核表达系统是指在真核是指在真核细胞中胞中表达外源基因的体系表达外源基因的体系主要有：主要有：酵母、哺乳酵母、哺乳动物、昆虫物、昆虫细胞胞（杆状病毒）系（杆状病毒）系统和高等植物系和高等植物系统二、外源基因在真核二、外源基因在真核细胞中的表达胞中的表达（一）真核表达系（一）真核表达系统的的优缺点缺点优点：点：•可表达克隆的可表达克隆的cDNA或真核基因或真核基因组DNA •可可进行糖基化、磷酸化、乙行糖基化、磷酸化、乙酰化等修化等修饰•某些真核某些真核细胞可将外源基因表达胞可将外源基因表达产物直物直接分泌至接分泌至细胞培养基中胞培养基中 缺点：缺点： 操作技操作技术难、、费时、、费钱（二）真核表达（二）真核表达载体体大多是大多是穿梭穿梭载体体※含有原核克隆含有原核克隆载体的体的复制子、抗性复制子、抗性筛选基因和基因和MCS等序列等序列※含有真核含有真核细胞的胞的启启动子、增子、增强子、剪子、剪接信号、接信号、转录终止信号和止信号和PolyA化信化信号及号及遗传选择标记等等组件件（三）外源基因（三）外源基因导入和入和转染染细胞的胞的筛选外源基因外源基因导入真核入真核细胞的方法胞的方法 病毒感染（天然方法病毒感染（天然方法 ）） 载体体转染染 （化学或物理方法（化学或物理方法 ））常用的常用的筛选方法有方法有1. 新霉素抗性新霉素抗性选择系系统 2. 胸苷激胸苷激酶基因基因—HAT选择系系统 3. 二二氢叶酸叶酸还原原酶基因基因选择系系统 课堂讨论内容（课堂讨论内容（1））•结合自己的专业和研究课题，结合自己的专业和研究课题，选择一感兴趣的目的基因，试选择一感兴趣的目的基因，试述如何利用所学的述如何利用所学的DNA体外重体外重组技术组技术克隆出该基因（简述设克隆出该基因（简述设计方法）。

计方法）课堂讨论内容（课堂讨论内容（2））•结合自己的专业和研究课题，选结合自己的专业和研究课题，选择一感兴趣的目的基因，利用所择一感兴趣的目的基因，利用所学的学的基因工程技术基因工程技术知识，试述在知识，试述在原核细胞中如何获得该目的基因原核细胞中如何获得该目的基因的大量蛋白表达产物（请简述设的大量蛋白表达产物（请简述设计方案）计方案） ---生化研究生生化研究生课堂讨论内容（课堂讨论内容（3））•两位研究者同步通过两位研究者同步通过RT-PCR获得目的片获得目的片段，鉴定并纯化后利用段，鉴定并纯化后利用pBS-T 载体连接试载体连接试剂盒进行重组剂盒进行重组DNA的构建，在转化后进行的构建，在转化后进行平板筛选，结果一组未在含平板筛选，结果一组未在含Amp的的LB平平皿上长出菌落；另一组从含皿上长出菌落；另一组从含Amp的的LB平平皿上挑选单菌落，提取质粒皿上挑选单菌落，提取质粒DNA后进行限后进行限制性内切酶酶切鉴定时却制性内切酶酶切鉴定时却未在琼脂糖凝胶未在琼脂糖凝胶电泳中见到酶切的目的电泳中见到酶切的目的DNA片段片段，请分析，请分析原因并提出可行的解决方法。

原因并提出可行的解决方法。