HTR8-SVneo细胞增殖与侵袭特性及hCG对其调控机制的研究.pdf

H T R 8 - S V n e o 细胞增殖与侵袭特性及h C G 对其调控机制的研究H T R 8 ．S V n e o 细胞增殖与侵袭特性及h C G 对其调控机制的研究专业：免疫学研究生：李泽武导师：曲迅教授中文摘要妊娠是胚胎母体内发育成长的过程，妊娠期可分为3 个阶段：早期妊娠( 1 2周末以前) ，中期妊娠( 1 3 , - - 2 7 周末) 及晚期妊娠( 2 8 周以后至分娩) 正常妊娠过程中，胚泡植入有赖于滋养层细胞对子宫基质和血管侵袭滋养细胞对母体蜕膜侵袭的结果导致胎盘血液供应形成，从而为胎儿的正常发育提供了重要的保证大量的研究证实，妊娠早期阶段滋养层细胞的增殖与凋亡特性变化及其对子宫壁的“时空“ 性侵袭是妊娠成功与维持的关键滋养层细胞的这一独特的生物学活性受母胎界面微环境中的多种因素的调控，其中内分泌激素是重要的调节因素之一绒毛膜促性腺激素( h C G ) 是妊娠早期的主要内分泌激素之一，其浓度随孕周的增加而显著升高，而后维持一定时间段内的稳定水平大量的研究证实h C G 具有调节卵巢中雌孕激素的合成和分泌的功能，但其是否参与对滋养细胞增殖，凋亡及侵袭力的调控，目前研究报道较少。

有研究报道，异位妊娠患者血清h C G 的水平与滋养细胞浸润肌层的深度呈同步增加，表明h C G 可能参与滋养细胞侵袭力的调节，但其调控机制尚未见报道，本文拟通过观察h C G 对人滋养细胞系H T R 8 ．S V n e o 细胞增殖，凋亡以及侵袭力调控，以及参与其中作用的通路的研究，初步探讨了h C G 对于滋养层细胞增殖，凋亡的影响，对于滋养层细胞侵袭活性的影响及其参与的通路，为h C G 在滋养层细胞相关疾病方面的发病机制和临床应用提供新的理论依据1 ．目的体外模拟母胎界面h C G 刺激滋养层细胞的微环境，检测h C G 对H T R 8 ．S V n e o细胞增殖活性与侵袭功能的影响及其机制，揭示母胎界面微环境中滋养层细胞生山东省医学科学院硕士学位论文存与侵袭行为的的分子基础，为滋养层细胞疾病与h C G 的关系提供进一步的理论依据，从而有利于滋养层细胞疾病发病与治疗的认识和h C G 的临床应用2 ．方法2 ．1H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞的培养与收取；2 ．2M T T 检测H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞增殖；2 ．3 流式细胞术检测H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞的凋亡；2 ．4R T - P C R 检测H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞腺苷受体和金属基质蛋白酶M M P ．2 的表达；2 ．5明胶酶谱检测金属基质蛋白酶M M P ．2 的分泌3 ．结果3 ．1随着h C G 刺激浓度的增加，H T R 8 一S V n e o 滋养细胞的生长率增加( 尸 I O I U ／m L >对照( 均P < O ．0 5 ) ：H T R 8 ．S V n c o 细胞培养上清行明胶酶谱试验，由图4 C 和D可见，结果表明不同h C G 处理组M M P - 2 的分泌均显著高于对照组( 均尸( n ∞) ，I O O I U ／m L 组对H T R $ ．S V n e o 细胞M M P - 2 产生的增强效应显著的高于I O I U ／m L处理组( P < n 酊) ，即呈现显著的浓度依赖效应。

^ - ．一= a = j 口岫‘= I = 】口㈨¨l ■ 4 一图4 不同浓度h C G 对H T R 8 - S V u e o 细胞M M P - 2 表达与分泌的影响A 扩增产物电泳图BM M P - 2 袭达水平的相对比较C 明胶酶谱测定H T R 8 一S V n e o 细胞M M P - 2 的生成D H T R 8 一S V n e o 细胞M M P - 2 分泌水平的相对比较3 ．讨论在哺乳动物的胚胎着床过程中，当胚胎发育到胚泡阶段时随着滋养层细胞侵入内膜与母体的蜕膜共同形成胎盘，即母胎界面，滋养层细胞是母胎界面中最为，滋养层细胞正常增殖与侵袭活性的维持与发挥是妊娠是否成功的关键因素细胞捅亡是细胞死亡的一种主动形式，它是细胞在一定的生理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的生理性死亡，它具有一系列的形态和生化特性，而与细胞坏死加以区别在形态上首先是细胞变圆，随即与邻居细胞脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞融台，核染色质密度增高呈半，熏山东省医学科学院硕士学位论文月形，并凝聚在核膜周边，核仁裂解，进而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包裹，内涵物不外溢的细胞小体圈。

自1 9 7 2 年，K n e r r 等首次报道细胞凋亡现象以来，已被普遍应用到生命科学的诸多研究领域研究发现细胞凋亡在机体生长发育、细胞分化或病理状态下具有重要的生理和病理意义，细胞凋亡已成为当今生命科学领域的研究热点之一【2 3 J 胎盘滋养层控制着母胎之间气体、营养物质，代谢物的交换许多研究表明妊娠过程中存在滋养层细胞凋亡的现象，研究者认为滋养层细胞的凋亡在调控细胞的增殖、维持胎盘组织结构和功能完整性上发挥重要的作用N e l s o n ( 1 9 9 6 )最先发现正常足月胎盘局部缺失是一个常见的组织学特征，在缺失处有纤维素沉积，取纤维沉积处组织电镜下观察，发现滋养层细胞具有凋亡细胞的超微结构改变，用凝胶电泳检测正常足月胎盘D N A ，发现典型的梯形泳带，表明胎盘细胞的凋亡为一生理现象【2 4 1 后来S m i t h 等( 1 9 9 7 ) 收集人正常妊娠早期和晚期的胎盘，用光镜、电镜及T U N E L ( 末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d U T P 切口末端标记) 等方法证实，正常妊娠早期和晚期都存在着胎盘细胞的凋亡，晚期胎盘细胞的凋亡显著高于早期，且滋养层细胞占凋亡细胞的大多数【2 5 1 。

滋养层细胞处在不断的发生增殖与凋亡的过程之中，这两个过程同时在滋养层细胞不断向蜕膜发生侵袭的过程中维持着动态平衡滋养层细胞增殖／凋亡二者之间的平衡作用的失调会使滋养层细胞的侵袭活性发生异常的变化，从而导致各种滋养层疾病的发生，比如妊娠期高血压综合症，葡萄胎，绒毛膜癌等疾病的发生都与滋养层细胞活性的异常改变密切相关，滋养层细胞的正常活性的维持受到体内多种因素的严格调控例如胎盘所分泌的各种激素，滋养层细胞表面的分子受体，所分泌的细胞因子等等有研究表明，h C G 在受孕后1 0 一1 4 天开始分泌，6 0 一7 0 天达到高峰在妊娠的前8 周增值很快，以维持妊娠在大约孕8 周以后，h C G 逐渐下降，直到大约2 0 周达到相对稳定由此可见在妊娠的早期阶段，胎盘微环境的剧烈改变尤其是h C G 显著增多会从各个方面影响滋养层细胞的生物学活性，因此本实验通过研究发现随着h C G 作用于H T R 8 ．S V n e o 细胞刺激浓度的升高，H T R 8 ．S V n e o 滋养层细胞的凋亡率下降，细胞的增殖能力增强对人类来说，妊娠的成功与否直接取决于胎盘的建成和维持，滋养层细胞迁移和侵入母体子宫组织和螺旋动脉的过程是胎盘建成的重要事件，正常情况下需2 0H T R 8 - S V n e o 细胞增殖与侵袭特性及h C G 对其调控机制的研究要细胞外基质的酶学降解，血管生成，滋养层细胞分化等共同协调作用而完成。

滋养层细胞侵入的过度和不足都能引起一些重要的妊娠疾病如绒癌、先兆子痫和宫内胎儿生长抑制等细胞外基质( E C M ) 的有序降解、合成和重塑是滋养层细胞侵袭过程中的主要事件【2 6 】滋养层细胞主要通过分泌金属基质蛋白酶来执行这一功能，基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要C a 2 + 、Z n 2 + 等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由5 个功能不同的结构域组成：( 1 ) 疏水信号肽序列；( 2 ) 前肽区，主要作用是保持酶原的稳定当该区域被外源性酶切断后，M M P s 酶原被激活；( 3 ) 催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；( 4 ) 富含脯氨酸的铰链区；( 5 ) 羧基末端区，与酶的底物特异性有关其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性M M P s 成员上述结构的基础上各有特点各种M M P 间具有一定的底物特异性，但不是绝对的同一种M M P 可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种M M P 降解，但不同酶的降解效率可不同M M P s 几乎能降解E C M 中的各种蛋白成分，破坏细胞侵袭的组织学屏障，在细胞侵袭中起关键性作用，它在各种细胞尤其是肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶【2 7 , 2 8 】。

目前M M P s 家族已分离鉴别出2 6 个成员，编号分别为M M P l “ - ' 2 6 根据作用底物以及片断同源性，将M M P s 分为4 类Ⅳ型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为9 2 k D ，命名为M M P 一9 ；另一种非糖化，分子量为7 2 k D ，被称为M M P ．2 t 2 9 1 当前对M M P ．2 ，M M P 一9 的研究较深入M M P ．2 是M M P s 中含量最丰富和分布最广泛的一种酶，又称明胶酶A ，它是以酶原的形式存在M M P 一2 基因位于人类染色体1 6 q 2 1 ，由1 3 个外显子和1 2 个内含子所组成，结构基因总长度为2 7 k b ，与其他金属蛋白酶不同，M M P ．2基因5 ’旁侧序列促进子区域含有2 个G C 盒而不是T A T A 盒【3 们活化的M M P 一2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用【3 1 1 除E C M 组分外，包括生长因子、生长因子受体、细胞表面受体等胞外非基质成分也能成为M M P 的作用底物。

由于M M P s的重要生理功能，其分泌和活性必然受到高度调控，M M P s 的调节机制极其复杂，包括来自转录水平、m R N A 半衰期、分泌、定位、酶原激活和蛋白水解活性等方方面面的调节作用M M P ．2 同时是M 2 “ Ⅵ' P s 中含量最丰富和分布最广泛的一种2 1山东省医学科学院硕士学位论文酶，又称明胶酶A ，其特异性底物是I V 型胶原，而I V 型胶原是基膜的主要组分【3 2 1 M M P ．2 以酶原形式分泌，其活化需要膜型金属基质蛋白酶的协助在绒癌细胞系中我们发现可调节M M P 分泌活性的物质对绒癌细胞的浸润转移产生影响作用，在绒癌细胞上有绒毛膜促性腺激素受体的表达，研究发现高浓度长时间的h C O 作用可通过改变M T - M M P 和T I M P 转录表达的变化影响绒癌细胞的侵袭性【3 3 1 我们的实验研究发现h C G 刺激H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞后，M M P 一2 的表达与分泌与h C G 呈剂量依赖性，即h C G 能够促进H T R 8 ．S V n e o 滋养细胞M M P ．2的表达与分泌，从而使其侵袭性增强。

由此可见，早期妊娠阶段hC G 这种激素的重要作用，它可以从增殖，凋亡，侵袭性等各个方面立体的调节滋养层细胞的生物学活性，调控其向子宫内膜的侵入但是，h C G 对滋养层细胞增殖，凋亡，侵袭活性的影响是通过何种的方式进行的，是否与胎盘微环境的改变密切相关，即母滋养层细胞对于宫壁组织( 包括血管) 的侵入是一个伴随着绒毛形成的渐进过程早孕期的胚胎发育及胎盘形成是在相对缺氧的环境下进行的，h C G 作用的发挥是否与低氧这种特异性的微环境具有相关性，对于这个问题在下面的实验中进行探讨4 ．结论4 ．1h C G 使H T R 8 ．S V n e o 细胞增殖率升高，凋亡率下降，呈浓度依赖性4 ．2h C G 使H T R 8 ．S V 。