四物汤对辐射小鼠造血功能影响的初步探讨.pdf

四物汤对辐射小鼠造血功能影响的初步探讨路晓钦? 高? 月? 刘永学? 谭洪玲? 马增春( 军事医学科学院放射医学研究所药理毒理研究室?北京 100850)摘? 要? 目的: 对察四物汤对 3?5Gy?射线照射小鼠造血系统的影响, 探讨四物汤作用机制方法: 通过外周血象观察、 造血祖细胞体外培养、 MTT 法检测四物汤及其拆方诱导 NIH3T3 细胞上清对 G- CSF 依赖细胞株 NFS-60 增殖等指标的影响研究四物汤的作用机制结果: 四物汤显著升高 3?5Gy?射线照射小鼠外周血白细胞、 血小板, 促进其造血祖细胞 CFU- GM、 CFU- meg、 CFU- mix 集落的增殖; 四物汤诱导的 NIH3T3 细胞上清能显著促进 G- CSF 依赖细胞株 NFS- 60 细胞的增殖结论: 四物汤对辐射小鼠造血细胞的作用机制与刺激 NIH3T3细胞产生类 G- CSF 作用或与 G- CSF 产生协同作用而促进外周血白细胞、 血小板恢复有关主题词? 血虚/ 中医药疗法? 四物汤/ 治疗应用? 辐射损伤? 造血系统/药物作用 ? 小鼠? ? 四物 汤由熟 地 Radix rehmanniae、 当归 Radix angelicaesinensis、 白芍 Radix paeoniae alba、 川芎 Rhizoma chuanxiong 组成, 具有增强免疫、 活血补血等功效, 临床上应用广泛。

近年来, 国内外学者对四物汤对辐射引起的造血系统的影响进行了初步的研究[ 1~ 3]但对四物汤在射线照射小鼠造血系统方面的作用机制研究不足, 本文观察了四物汤对照射小鼠造血的影响并对其作用机理作了初步探讨1? 实验材料1?1? 实验动物分组? C57BL/6J 小鼠, 6~ 8 周龄, 体重 20?2g, 雌性; 由军事医学科学院实验动物中心提供, 一级动物饲养室饲养将小鼠按体重随机分为 3 组: 正常对照组、 模型组、 四物汤组小鼠常规饲养 3~ 5d 后,60Co?射线全身一次照射, 治疗组照后立即灌胃给药, 连续 7d, 每 d1 次, 0?2ml/次( 相当于四物汤 10g/ kg), 正常对照组和模型组则给予等体积的生理盐水1?2? 主要试剂与仪器? RPMI1640, Gibco BRL 公司产品; 胎牛血清, 马血清, 北京军区兽医防治中心提供; G- CSF, 日本麒麟株氏会社产品; CO2培养箱, Napco- 5410; 酶 标仪, Wal?lacVic ToR1420, 美国产品; 自动血球 计数仪( 日本 Sysmex-800); CO2孵育箱; 倒置相差显微镜(AO 公司生产) ; ?剂量辐射检测控制仪(军事医学科学院 QT- 3 型优质 OCL) 。

1?3? 药物及制备? 四物汤全部药物均购自北京同仁堂中药厂按?太平惠民和剂局方?规定的剂量称取, 熟地 15g、 当归10g、 白芍 10g、 川芎 6g, 共计 41g, 经水煎、 过滤、 浓缩、 配制成100% 药液(即每 ml药液含生药 1g); 其它拆方组均按相当于四物汤的量进行拆方分组, 按同样的方法制备成相当于四物汤浓度的药液, 置 4? 保存备用体外实验将过滤除菌的四物汤药液倍比稀释成不同浓度, 加入到细胞培养体系中1?4? 细胞系? NIH3T3细胞为小鼠胚胎期成纤维细胞( 本院放射医学研究所实验病理研究室惠赠), 用含 8% 胎牛血清的RPMI1640 培养液按贴壁常规培养; NFS- 60 细胞为 G- CSF依赖的小鼠源性粒系白血病细胞株(本院放射医学研究所放射病治疗研究室惠赠), 含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养液, 加入 G- CSF 至终浓度为 10ng/ml, 隔天换液 1次2? 实验方法2?1? 外周血象检测 ? 各组动物( 按体重及外周血象随机分组, 每组 10 只) 分别于制模前、 制模后 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 17、21d, 每只实验小鼠尾静脉取血 20?l, 用 Sysmex- 800 自动血球计数仪检测外周血象。

2?2? 造血祖细胞培养? 照射后第 7d, 各批次活杀 3 只小鼠,无菌条件下取股骨, 用 RPMI1640 培养液冲出骨髓细胞, 过 4号针头制成单细胞悬液, 计数有核细胞, 并计算出接种细胞悬液量, 使其于培养体系中的有核细胞浓度为 1? 105/ml参照刘秀珍[ 4]介绍的方法并稍加改动, 检测粒系( CFU-GM) 、 巨核系( CFU- meg)祖细胞集落2?3? NFS- 60 细胞生长曲线的测定 ? 将指数生长期的 NFS- 60 细胞用 RPMI1640 培养液洗涤 3 次, 血球计数仪计数细胞, 然后用含 5% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基调整 NFS- 60细胞浓度为 8? 108/ml, 每孔 50?l 加入 96 孔板中; G- CSF 因子以上述培养基3 倍递减稀释后, 每孔加50?l, 每组做 6个复孔, 在 37? , 5% CO2孵箱中培养 2d, 培养终止前 4h 加入 MTT(5mg/ml)20?l, 在 37? , 5% CO2孵箱中继续培养 4h 后弃上清, 加入 200?lDMSO, 振荡助溶, 在酶标仪上置 490nm 波长处测 OD 值。

以造血因子浓度为横坐标, 以 OD 值为纵坐标绘制生长曲线2?4? 四物汤及其拆方条件培养液的制备及对 NFS- 60 细胞增殖影响的测定? 计数指数生长期 NIH3T3 细胞, 加入四物汤并用培养液调整细胞浓度为 5? 104/ml、 药物终浓度分别为 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0?5、 0mg/ml, 置培养瓶中; 在 37? 5% CO2孵箱中培养 3d, 取上清备用; 将指数生长期的 NFS- 60 细胞用 RPMI1640培养液洗涤 3 次, 计数并用含 5% 胎牛血清的RPMI1640调整其浓度为 1? 106/ml; 在 96 孔平底板上每孔加50?l 诱生上清、 50?lNFS- 60 细胞悬液, 每组设 12 个复孔, 按上法在490nm波长处测 OD 值各拆方组药物以相当于四物汤为 4mg/ml 的浓度测定对 NFS- 60 细胞增殖影响2?5? 统计学处理? 各组实验数据以均值? 标准差(? x ? s) 表示两组间的差异显著性分析用 t 检验3? 结果?216?? ? ?? ? ? ? ? 中国中医药科技2002 年第 9卷第 4 期3?1? 四物汤对照射小鼠外周血象的影响如图 1所示, 照后第 5、 7、 9、 11d 四物汤组白细胞数明显高于对照组, 具有统计学差别; 进一步分析表明, 四物汤组白细胞数恢复至 50% 的时间比对照组提前了 4d, 且其它各检测时间点均比对照组有所提高。

图1? 四物汤对 3 ?5Gy 照射小鼠外周血白细胞的影响? ? 如图 2所示, 四物汤组照后血小板数在各检测时间点上均比照射对照组为高, 且在照后第 1、 5d 有显著性差异图2? 四物汤对 3 ?5Gy 照射小鼠外周血血小板的影响3?2? 四物汤对照射小鼠造血祖细胞集落的影响? ? 小鼠在受到 3?5Gy 照射后, CFU- GM、 CFU- meg、 CFU-mix 集落的形成能力降低用四物汤治疗后, CFU- GM、 CFU- meg 集落数明显回升, 与照射对照组相比有显著性差异表 1四物汤对照射小鼠造血祖细胞集落的影响(? x ? s, n= 6)组别CFU- GM ? ? ? ?CFU- meg? ? ? ?CFU- mix ? ? ? ?正常组629?80? 14 ?24* * *15 ?50 ? 3?42* * *23 ?50? 5?20* * *照射对照组 62 ?80 ? 7 ?401 ?25? 0?53 ?75? 1?26SWT 组177?60? 10 ?55* * *9 ?00? 2?58* *19 ?50? 2?98* * *? ? 与照射对照组比较* P< 0?05,* * P< 0?01, * * * P< 0 ?0013?3? NFS- 60细胞的 G- CSF 剂量依赖生长曲线? ? 图 3所示 NFS- 60 细胞的生长曲线与文献相同[ 5], 证明本细胞株对 G- CSF 因子的依赖性。

3?4? 四物汤诱生 NIH3T3 细胞上清对 NFS- 60 细胞增殖的影响图 4所示低浓度四物汤诱生 NIH3T3 细胞上清对 NFS-60 细胞有促增殖作用; 高浓度时, NIH3T3 成纤维细胞不能在培养液中生长四物汤浓度为 4mg/ml 时, 其诱导 NIH3T3 成纤维细胞上清对 NFS- 60 细胞增殖作用最强 ? 由图 5结果所示, 四物汤、 当归、 白芍诱生 NIH3T3 细胞上清可显著促进 NFS- 60 细胞的增殖, 地黄则起抑制作用,川芎作用不显著我们另外的拆方结果表明: 在两味药配合中, 当归+ 白芍作用最强; 在三味药配伍中当归+ 白芍+ 川芎作用最强图 3? NFS- 60 细胞的 G- CSF 剂量依赖生长曲线图 4? 四物汤诱生 NIH3T3 细胞上清对 NFS- 60 细胞增殖的影响3?5? 四物汤及其拆方诱生( 相当于四物汤 4mg/ml) NIH3T3细胞上清对NFS- 60细胞增殖的影响? 见图 5图 5? 四物汤及其单味药诱生NI H3T3 细胞上清对NFS- 60 细胞增殖的影响4? 讨论成纤维细胞作为机体结缔组织的主要细胞成分, 不仅具有活跃地合成细胞间质的功能, 还可借助细胞间直接作用及产生造血调控因子广泛地影响血细胞的发生。

在造血组织内, 它是造血诱导微环境(HIM)中重要的细胞成分, 与其他基质细胞一起协调造血, 构成造血细胞赖以生长、 发育的内环境[ 6, 7]而机体内非造血组织来源的成纤维细胞, 它们或与?217?2002年第 9 卷第 4 期中国中医药科技? ? ? ? ? ? ??造血因子协同作用, 或产生造血生长因子, 亦参加造血发生的调节[ 8, 9, 10]目前的研究表明成纤维细胞所产生的调控造血的细胞因子有 GM- CSF、 G- CSF、 M- CSF、 EPO 等, 对造血干、 祖细胞的分化发育起重要的调控作用, 其中 G- CSF 是一种重要的造血生长因子G- CSF 的作用不仅限于后阶段粒系定向祖细胞, 近年资料表明亦能促进多能干细胞的增殖,刺激巨核细胞集落生长[ 11, 12]本实验前期结果证明四物汤能够显著升高血虚小鼠外周血白细胞、 血小板, 促进造血祖细胞 CFU- GM、 CFU- meg、CFU- mix 集落的增殖为进一步探讨四物汤的作用及配伍机制, 利用MTT 法研究四物汤及其拆方诱导 NIH3T3 成纤维细胞上清对 G- CSF 依赖细胞株NFS- 60 增殖的影响。

结果表明: 四物汤在终浓度为 4mg/ml 时, 诱生 NIH3T3 细胞上清对NFS- 60增殖作用最强, 这可能是四物汤升高血虚小鼠外周血白细胞, 血小板, 促进造血祖细胞 CFU- GM、 CFU- meg集落增殖的分子基础在此基础上, 我们的拆方实验表明,白芍诱生NIH3T3细胞上清的活性在四物汤方剂中起主要作用但是四物汤诱生NIH3T3细胞上清具体有什么变化? 而且四物汤对不同组织来源的成纤维细胞的诱生上清有什么不同? 正是本课题进一步研究的内容国家自然科学基金资助项目 NO30070913)? ? 参考文献1? Hsue- Yin Hsu, Yau- Hui Ho, Chun- Ching Lin. Protection of mousebone marrow by Si- Wu- Tang against whole body irradiation. Journal ofEthopharmacology. 1996; 52: 1132? 马增春, 高月, 刘永学, 等? 四物汤。