AccQ安装调试氨基酸分析.doc

关于AccQ • Tag的安装调试程序AccQ • Tag方法是Waters专为柱前衍生HPLC分析氨基酸而开发的创新方法, 其核心在于名为AQC（6-氨基唾咻基-N-轻基琥珀酰亚胺基-氨基甲酸酯）的专利衍 生剂可用于AccQ • Tag方法的Waters新的HPLC系统包括:Alliance系统,600 泵低压梯度系统,515泵咼压梯度系统以及Breeze系统等在为用户调试 AccQ • Tag时，应根据不同的系统配置，选用相应的连接方式和梯度表1. 安装前的准备工作：按AccQ • Tag方法的仪器配置要求，清点HPLC部件及相关化学品，并与用户 联系准备好所需的有关辅助设备，具体项目如下：1. 在完成HPLC系统安装的基础上，检杳落实以下必备项目，如有斧错，则不能进 行AccQ • Tag调试：A. 2695是否配置了脱气装置（氨气脱气或脱气机），柱温箱和柱塞杆清洗 装置，以及300 u 1（或150 u 1）微量进样小瓶（带塑料弹簧）P/N WAT094170（P/NWAT094171）;B. 600泵系统是否配置了脱气装置（氨气脱气或脱气机），柱温箱;若配置了 717plus自动进样器，需配250 U1微量样品瓶（P/N WAT072704）和弹簧（P/N WAT072708）;及另一根 0.009〃 X3 SS 管（红管）；C. 515X2系统是否配有梯度混合器（Mixer, P/N WAT05151 &包含三通一个, 专用过滤器一个，及混合器一个）和PCM（泵控制器,P/N WAT200314）以及柱控 温系统（P/N WAT038039）;若配有717plus自动进样器，需配250 u 1微量样品瓶 （P/NWAT072704）和弹簧（P/N WAT072708）;及另一根 0.009" X3 SS 管（红管）；是 否配置了柱温箱。

D. Breeze 1525系统需配置柱温箱,若配有717plus自动进样器，需配25010微 量样品瓶（P/NWAT072704）和弹簧（P/N WAT072708）;及另一根 0.009" X3 SS 管 （红管）.E. AccQ • Tag Chemistry Package （化学品包,P/N WAT052875）是否完整齐备, 内容物包括：P/N WAT052880P/N WAT052885P/N WAT052890P/NWAT007571P/NWAT088122P/N WAT052874★ AccQ • Fluor™ Reagent Kit(衍生用试剂)★ AccQ • Tag Column 3.9mm X 150mm★ AccQ • Tag 流动相 A 浓液(950ml X 2)★ AccQ • Tag 衍生管 6 X 50mm (72/pkg X4)★ Amino Acid Hydrolysate Standard★ AccQ • Tag 手册2. 现场安装前应与用户联系，要求其必备下述设备,用具与化学品（否则需安装工程 师自备）：A. 涡旋搅拌器B. 微量移液器（100|41）及干燥吸头若干C. 烘箱（可恒温至55C）以上为衍生用D. 超声波清洗器E. pH计（精确到0.01）（选项）F. 溶剂过滤装置G. 100ml和1000ml量筒（配制流动相用）H. 500ml或1000ml烧杯（或其它洁净的容器，配制A液用）I. 乙睛（HPLC级）J. 当日制备之高纯水或加高猛酸钾重蒸的二次蒸馆水（18MQ,不含有机污染物）以上为配制流动相用K. 6M硝酸及pH试纸（pH范围1—14） 以上为钝化系统用%1. HPLC系统（AccQ・Tag用）安装1. 按AccQ • Tag对管路的要求连接各部件：AccQ • Tag对系统管路的要求是:所有部件之间的管路连线均用0.009"的不 锈钢管路连接.对于Alliance系统,色谱柱与检测器之间用尽可能短的0.009"的不锈钢管路连 接即可；对于600低压梯度系统，若是717自动进样器，需将其蓝管（入口管）换成红管，若 是7725i手动进样器，与进样器（入口与出口）连接的管路均用0.009"的不锈钢管路 或红管；对于515X2高压梯度系统,A,B泵出口与三通之间用0.02”不锈钢管路连接，三 通一专用过滤器一混合器均用0.009"的不锈钢管连接,混合器与进样器之间，进 样器与色谱柱之间均用红管（对717P1US自动进样器）或0.009"的不锈钢管路（对 7725i手动进样器）连接。

对于Breezel525系统，连接要求同515X2系统2.717自动进样器应用200|al Loop环；7725i进样器应用200pl Loop环3. 2475荧光检测器的出口管建议用较长的0.02”不锈钢管路直接通到废液瓶中, 这样可能会减少气泡的干扰；2475的入口管和2487紫外检测器出入口管均用 0.009”的不锈钢管若用户同时有2475荧光检测器和2487紫外检测器时，需将二 者串联，且2487在前,2475在后由于2487的入口管是预装好的，故需用PEEK接 头与柱出口相接4. 柱温箱的连接:进样器出口与过滤器连接，再与柱温箱入口管相接5. 将AccQ • Tag专用柱装入柱温箱（若用户已配置Nova-Pak C18 Guard-Pak保 护柱，可将保护柱接在过滤器后,AccQ • Tag柱前）6. 用50ml 6M硝酸钝化色谱系统，具体操作如下：将色谱柱取下，用两通连接进样器和检测器，将所有吸滤头放入纯水中，以lull /min流速过渡（约需30分钟），待管路中有机溶剂洗脱干净,再换用6M硝酸洗 系统，待50ml硝酸用完，再换纯水冲洗，直至出口水pH=6-7,然后用色谱纯甲醇浸 润系统约半小时（低流速较好，例如0.5ml/min）,钝化完成。

1. AccQ・Tag的调试（一）.流动相的配制：▲A液：按l:10（V/V）将AccQ • Tag A浓液（WAT052890）用水稀释即可（除非 必要，一般不需调pH值）例如:用100ml量筒量取30mlAccQ • TagA浓液，倒于 500ml烧杯中;用500ml量筒量取300ml高纯水淮9入上述500ml烧杯中，搅拌，混和 均匀,（此液足够本次调试之用）将配好的A液倒入洁净的500 ml溶剂瓶中，放到 超声波清洗器中超声脱气1分钟,备用★注：向用户强调浓A液的储存方法:密封置于4-C冰箱中，防止挥发▲ B液：对于2695和600系统，无需配制，将纯乙月青放于B通路即可；对于515X2和1525 Breeze系统,B液是60/40（V/V）乙月青/水配制时应分别 量取乙月青和水，再混和;举例如下：用100ml量筒量取90ml乙睫倒入200ml烧杯，再 用100ml量筒量取60ml高纯水，倒入上述装有乙月青的烧杯中，用玻棒搅拌混和均匀, 倒入溶剂瓶中，放到超声波清洗器中超声脱气半分钟,备用★注：此B液最好现用现配，不宜长期放置,以免乙睛挥发，比例改变，影响氨基 酸的分离和色谱的重现性。

▲C液：对于2695和600系统，将新鲜制备并经超声脱气的高纯水放于C通路 即可；★注：在配制流动相时，水的质量是至关重要的，用户若无合乎要求的高纯水, 则会给后面的氨基酸分离带来干扰判断水质好坏的一个简单方法是做一次 Codition Column（平衡色谱柱）或做一次空白进样，在空白梯度的色谱图上35分钟 之前如无明显的杂质峰（在20分钟左右有时会有一个小峰或突起的宽峰），则 配制A液的水质没有问题必要时可用市售无菌纯净水（例如:屈臣氏，娃哈哈等知 名品牌的饮用纯净水，其它品牌，尚需试验）来代用二）.用流动相平衡系统（此操作在衍生样品之前进行,可节省调试时间）：在分别用A、B、C流动相充满泵头管路（即，进行泵排气操作）之后，先用纯水 以lml/min流速冲洗系统15分钟,（对于515系统,可先用B液冲洗系统），然后用A 液平衡系统20分钟（lml/min流速），以下即可密下述AccQ • Tag色谱条件设置参数, 做一次空白梯度平衡（可用M32或Empower采集画面中的Condition Column功能,或者将进样量设为0,运行一次进样操作）注：在上A液之前，一定先用纯水过渡，以防止A泵或A路以前用过甲醇 或乙睛等有机溶剂，与缓冲盐混合会析出沉淀，堵塞管路。

AAccQ • Tag的色谱条件如下：柱温:37C,紫外检测波长：248nm;荧光检测：激发波长250nm,发射波长 395nm;按下述各系统适用的梯度表设置梯度和单次运行时间：▲表一.2695系统适用的梯度表（未加保护柱时）时间 分钟流速ml/minA液%B液%C液%曲线起始1.010000*0.51.0991011181.095506191.09190629.51.0831706331.00604011361.01000011601.()0010011901.006040111201.00604061210.2060406★注:梯度运行时间为45分钟▲表二.2695系统适用的梯度表（加保护柱*时）时间 分钟流速ml/minA液%B液%C液%曲线起始1.010000*0.51.0991011181.095506191.09190629.51.0831706351.00604011381.01000011601.00010011901.006040111201.00604061210.2060406★注一:梯度运行时间为47分钟★ ★注二:用于 AccQ • Tag 分析的保护柱是 Sentry Guard (Nova-Pak C18)。

▲ 表二.600_717(7725i)_2487系统适用的梯度表时间 分钟流速ml/minA液%B液%C液%曲线起始1.010000*171.091546241.0801736321.06820126341.06820126351.0060406371.0060406381.0100006601.00010011901.006040111201.00604061210.2060406★注：梯度运行时间为45分钟▲表四.600_717_2487(两孔脱气机)系统适用的梯度表时间 分钟流速ml/minA液%B液%曲线起始1.01000*171.09196241.082186。