离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

离子交换柱层析法分离氨基酸指导老师：肖靓小老师：田春丽、李洁茜2021/6/301一、实验目的和要求1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和方法 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等2021/6/302二、实验原理 离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物 各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果2021/6/303 树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关水合离子半径愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大其中静电力起主要作用 在ph=5.8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性本试验所用氨基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸，pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，pI=9.74 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应2021/6/304三、实验试剂1、732阳离子交换树脂2、2 mol/L盐酸溶液。

3．2 mol/L氢氧化钠溶液4. 标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL的0.1mol/L盐酸溶液5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的比例混合6. 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液(pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L的缓冲液和钠离子浓度为0.90mol/L的缓冲液)取柠檬酸14.25g、氢氢化钠9.3g和浓盐酸5.25mL溶于少量蒸馏水后，定容至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加蒸馏水至100mL8．50%乙醇水溶液2021/6/305离子交换树脂转型示意图2021/6/306离子交换树脂分离氨基酸原理示意图2021/6/307四、实验器材MC99-3自动液相色谱分离层析仪层析管（20cmX1cm）专用试管（≥50支）水浴锅铝制试管架X2分光光度计玻璃棒移液管洗瓶硅胶管2021/6/308五、实验步骤1、树脂的准备： 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性待用方法如下：将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一小时（树脂换为氢型），倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。

2021/6/3092、连接装置梯度混合器→恒流泵→层析管→部分收集器2021/6/30103、装柱 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析管另一个同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度 注意： 1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水最后一段加水和放水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂，但也不能溢出2021/6/3011倒好的层析管端面平整，无气泡，约18cm高2021/6/30124．平衡： 将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取pH=5.8钠离子强度为0.45的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样）即可上样在平衡同时进行调速： 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。

2021/6/30135．加样: 平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶液弯月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为（0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左右加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品全部加在某一局限部位 注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树脂表面2021/6/3014加样示意图2021/6/30156.洗脱并收集: 将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为0.45与0.9的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个烧杯中其中0.45的加入到直接输出溶液的那个池，如图 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，1.5ml/管×50注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设置为512021/6/30167．氨基酸的鉴定： 向各管收集液中加1.5mL水合茚三酮显色剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周围几管都加在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加1.5mL的50%乙醇溶液，放置10min。

以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收值）以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线2021/6/3017 注意： 1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可水浴完成后用镊子和抹布把试管架拿出来 2. 应避免用手直接接触茚三酮2021/6/3018六、思考题1、为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂？2、为什么要使用梯度缓冲液来洗脱？为什么0.45的缓冲液加入到A池中？3、三次加入缓冲液的作用分别是什么？（平衡、加样、洗脱）4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的方案，并简述理由2021/6/3019预祝大家实验成功！2021/6/3020 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！。