园艺植物生物技术：第七章转基因植物.ppt

第七章 转基因植物目录•转基因技术现状及其应用•植物遗传转化技术•载体构建•遗传转化操作•转基因鉴定第一节植物遗传转化现状及其应用Nature has a rich source of variation转基因技术发展•1983年华盛顿大学成功将卡那霉素抗性基因导入烟草，同年4月美国威斯康星大学成功将大豆基因转入向日葵，标志着植物转基因技术的诞生•1985年，第一批抗病毒、抗虫害和抗细菌病的转基因植物进入田间试验•1986年，美国环保署允许世界第一例转基因作物——抗除草剂烟草进行种植•1994年，转基因延熟保鲜番茄——“FlavrSavr”获得美国食品药品管理局的批准进入市场销售，成为世界上第一个获许进行销售的转基因食品转基因植物重要里程碑转基因植物重要里程碑•19831983年首例转基因植物培育成功年首例转基因植物培育成功•19861986年转基因植物获准进入田间试验年转基因植物获准进入田间试验•19941994年转基因番茄在美国批准上市年转基因番茄在美国批准上市•19961996年年GMOGMO面积面积170170万万haha•20122012年全球转基因作物种植面积年全球转基因作物种植面积170.3 million ha170.3 million ha2012年全球转基因作物种植按作物分-2012按性状分几种作物种植GMO比例全球种GMO国家分布我国批准我国批准6 6个转基因作物商品化个转基因作物商品化l l抗病毒甜椒（北京大学）抗病毒甜椒（北京大学）耐储存番茄（华中农大）耐储存番茄（华中农大）抗病毒番茄（北京大学抗病毒番茄（北京大学））转转CHSCHS基因矮牵牛（北京大学）基因矮牵牛（北京大学）抗虫棉（中国农科院研制）抗虫棉（中国农科院研制）抗虫棉（抗虫棉（孟山都公司研制）孟山都公司研制）转基因研究涉及的部分园艺作物•番木瓜•苹果•柿•荔枝•龙眼•红薯•草莓•梨•柑橘•桃n番茄n西瓜n葡萄nPepper n花菜n大白菜n李n马铃薯Production of transgenic plants resistant to diseasesApplication 1Diseases/viral diseases•Limit production•Affect quality•Influence growthq利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶的部分基因或反义核糖核酸复制酶的部分基因或反义核糖核酸抑制病毒编码的加工酶，已获得抑制病毒编码的加工酶，已获得3030多种抗植物病毒的转基因植物多种抗植物病毒的转基因植物研究成果Transgenic papaya resistant to PRSVFresh papaya productiona in state of Hawaii and in Puna districtYear  TotalPuna (x 1,000 lb)(PRSV enters Puna) 1992   55,80053,0101993   58,20055,2901994   56,20055,5251995   41,90039,2151996   37,80034,1951997   35,70027,810 (transgenic seeds released) 1998  35,60026,7501999   39,40025,6102000   50,25033,9502001   52,00040,000The yield and quality of Rainbow was exceptional, amounting annually to 125,000 L/acre vs. 5,000 L/ acre of non transgenic ones Sweet orange overexpressing PR protein from tomato: resistant to phytophthoraApple fire blight•fire blight:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 2000.ØLytic protein (LP)：Royal Gala, Galaxy 和M26Ø转avian LP’s SB-37,T-4 lysozyme：GalaØ转harpin（来于Fire blight细菌）ØNPR1蛋白：过量表达ØSilencing the DIPM kinase which is related to the occurrence of the disease.Production of transgenic plants resistant to pests and insectsApplication 2Aftermath of farm chemical•我国化学杀虫剂约占农药总量的我国化学杀虫剂约占农药总量的70%70%以以上，年产量上，年产量2222万吨左右，万吨左右，30%30%以上用于以上用于防治棉铃虫。

防治棉铃虫–19921992年至年至19961996年，年， 2424万余人农药中毒万余人农药中毒19921992年中毒人数就高达年中毒人数就高达7 7万多人，直接经万多人，直接经济损失达济损失达100100多亿元 •利利用用苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌（（BtBt））杀杀虫虫蛋蛋白白基基因因CryICryI和和CryIIICryIII，，分分别别获获得得抗抗鳞鳞翅翅目目和和鞘鞘翅翅目目害害虫虫的的转转基基因因植植物物（（番番茄茄、、马马铃铃薯薯、、烟烟草、杨树、水稻和棉花等）草、杨树、水稻和棉花等）–在在美美国国，，转转BtBt基基因因作作物物的的推推广广减减少少了了26.926.9亿美元的杀虫剂的使用亿美元的杀虫剂的使用–1986-19981986-1998年年转转基基因因作作物物田田间间试试验验中中，，抗抗虫作物占虫作物占29%29%研究成果Bt-cotton•China：：19911991年单价抗虫棉，年单价抗虫棉，19931993年，开展年，开展双价抗虫棉的创新研究双价抗虫棉的创新研究 –20052005年，国产抗虫棉已累计推广年，国产抗虫棉已累计推广90009000多万亩，多万亩，创造经济效益创造经济效益150150多亿元多亿元 ,20062006年，种植年，种植20002000万万亩亩•India: Bt cotton covers 8.1 m acres in 2006 –每亩可减少化学农药每亩可减少化学农药0.50.5公斤，每亩增加的收公斤，每亩增加的收益约为益约为140140元元 Non-Bt cottonBt cottonSource: CAAS抗虫转基因棉花获大面积推广抗虫转基因棉花获大面积推广Numbers of pesticide applications in Bt and non-Bt cotton in Hebei and Shandong in 1999-- reduced by 13 applications In 2000: by 12 applications In 2001: by 14 applications Percentage (%) of poisonings reported as numbers of farmers interviewed in Henan in 2000Cabbage looper粉蚊夜蛾 test Diamondback moth小菜蛾 testProduction of transgenic plants resistant to herbicideApplication 3GMO by traits-2012Transgenic soybean•1994年年5月美国月美国Monsanto公司耐除草剂公司耐除草剂“镇镇草宁草宁”大豆大豆‘Round up Ready（农达安）（农达安）’。

 Move to greener herbicide Benefits of Glyphosate 草甘磷草甘磷Tolerance in Crops Can use at any time - can wait until there is a problem Reduced herbicide use Very effective - Weeds very sensitive - GM crop very resistantGM canola surrounded by weeds- glyphosate+ glyphosateProduction of transgenic plants with altered development progressApplication 4—延迟果实成熟延迟果实成熟q利利用用反反义义RNARNA技技术术抑抑制制果果实实软软化化过过程程中中的的关关键键酶酶（（聚聚半半乳乳糖糖醛醛酸酸酶酶或或乙乙烯烯前前体体合合成成酶酶）），可使番茄果在储存期的软化延迟可使番茄果在储存期的软化延迟q19931993年年美美国国食食品品和和药药品品管管理理局局（（FDAFDA））批批准准上上市市的的第第一一个个转转基基因因食食品品————CalgeneCalgene公公司司的的转转基因延熟番茄基因延熟番茄FlavrFlavr SavrSavr（（保味）保味）q华华中中农农业业大大学学园园艺艺系系叶叶志志彪彪教教授授获获得得转转基基因因番番茄茄————百百日日鲜鲜（（Bioscience)Bioscience)华华番番一一号号是是我我国国第一个商品化生产的转基因产品第一个商品化生产的转基因产品对照对照转基因苹果转基因苹果乙烯生成减少的苹果•转基因苹果：转基因苹果：Ø乙烯生成减少乙烯生成减少70%Ø需更长时间软化需更长时间软化Ø硬度：高于硬度：高于CKØSSC：：高于高于CKØ比比CK耐贮藏耐贮藏3个月后不变褐的苹果Production of transgenic plants tolerant to abiotic stressesApplication 5•Approximately 70% of the genetic potential yield of major crops is lost by environmental factors. (Boyer, Science, 1982, 218: 443-448)Abiotic stressEnhanced growth in transgenic aspen耐盐番茄耐盐番茄•适宜保护地栽培的或适宜保护地栽培的或露地早春栽培；抗寒、露地早春栽培；抗寒、抗盐、无限生长型单抗盐、无限生长型单株，果高桩型；每果株，果高桩型；每果序序4-8果、坐果率高、果、坐果率高、单果重单果重70-100g，，糖度糖度5.0-6.0%，，Vc含量为含量为41.4mg/100g鲜重；鲜重；耐贮藏、利于通风透耐贮藏、利于通风透光，适于保护地栽培，光，适于保护地栽培，产量可达产量可达5000～～8000kg。

•将先将先进的抗旱的抗旱产品送入温室品送入温室进行行筛选；田；田间试验中中领先的先的产品表品表现优异；异；继续评估以评价抗旱性方面的表现继续评估以评价抗旱性方面的表现CONTROL对照照组WITH GENE 含基因含基因CONTROL对照组对照组WITH GENE 含基因含基因孟山都孟山都与巴斯夫合作与巴斯夫合作45抗旱玉米抗旱玉米2008年年农业进步展步展览会：会：含抗旱基因含抗旱基因 对照照组 转基因基因抗溃疡病的柑橘抗脱水的枳Production of transgenic plants with special value or traitsApplication 6Transgenic flowers with different flower colorq第一个转基因园艺植物是淡紫色的康乃馨第一个转基因园艺植物是淡紫色的康乃馨MoondustMoondust：把编码类黄酮羟化酶和二氢类黄：把编码类黄酮羟化酶和二氢类黄酮还原酶的基因转到白色康乃馨中，在转基酮还原酶的基因转到白色康乃馨中，在转基因植物中积累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色因植物中积累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色，，•改良作物营养品质植物类胡萝卜素代谢工程Shewmaker et al., Plant J, 1999; Lindgren et al., Plant Physiol, 2003; Paine et al., Nat Biotechnol, 2005; Rosati et al., Plant J, 2000; D‘Ambrosio et al., Plant Sci, 2004; Fujisawa et al., 2008; Zhu et al., PNAS, 2008; Apel and Bock, Plant Physiol, 2009; Maass et al., Plos One, 2009•生产特殊类胡萝卜素植物类胡萝卜素代谢工程Mann et al., Nat Biothechnol. 2000; Morris et al., Metab Eng, 2006; Jayaraj, et al., Transgenic Res, 2007; Suzuki et al., Plant Cell Rep, 2007; Zhu et al., PNAS, 2008; Fujisawa et al., J Exp Bot, 2009Golden rice -Carotene Pathway in PlantsIPP异戊二烯焦磷酸异戊二烯焦磷酸GGPPPhytoeneLycopene  -carotene(vitamin A precursor)Phytoene synthasePhytoene desaturaseLycopene-beta-cyclaseξ-carotene desaturase Problem:Rice lacksthese enzymesNormalVitamin A“Deficient”RiceGA-20氧化酶部分正义抑制的苹果•Reduced concentration of GA1 and GA20 in shoot tips and young leaves. The dwarf type can be reversed by GA3.•LFY encodes a plant specific transcription factor and is considered a master regulator of floral meristem development.•AP1 is a member of the MADS-box gene family of transcription factors ,which play critical roles in development processes across the plant, animal and fungal kingdoms.•FLOWERING LOCUS T (FT) is one of the flowering-time genes in Arabidopsis genes and is characterized as a floral pathway integrator.Genes involved in floral developmentOverexpression of LEAFY in citrus transgenic plants.(A) Transgenic shoot grafted in vitro on a nontransgenic rootstock showing a precocious terminal flower five weeks after regeneration. (B) Transgenic plant showing a weeping growth habit. (C) Leaves from transgenic plants showing various degrees of curling (top) compared to leaves from nontransformed control plants (bottom). (D) Vegetative shoot from a transgenic plant showing the reduction of thorns and small curled leaves (right) compared to a vegetative shoot from a nontransformed control plant of the same age (left). (E) Transgenic plant flowering 16 months after its transfer to the greenhouse. (F) Ripened fruit from a transgenic plant grown in the greenhouse.不引起过敏的苹果Transgenic tomato producing insulinTransgenic tomato producing insulin•按照植物偏爱的密码子设计并合成了人胰岛素的A链和B链的编码序列，并通过以某种方式连接成为一个ORF的人胰岛素基因（180bp） ，依据软件分析使其产物模拟天然的胰岛素结构。

该基因受控于番茄果实专一性启动子，在番茄果实中高效表达通过生吃番茄的口服途径可改善胰岛素依赖型糖尿病人自体免疫状况，达到治疗效果亦可从番茄果实中纯化出人胰岛素，做成注射剂型第二节第二节 转基因转基因技术技术★★转基因技术（转基因技术（Transgenic technique）） 运用分子生物学技术将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状、改造生物的技术转基因技术的特点：转基因技术的特点：1）突破物种界限，从DNA分子水平上有目的地、有效地改造生物2）按照人们的意志定向的改变生物的遗传性状3）避免在自然情况下会限制不相关品种间DNA交换的障碍4）当转入的基因整合到染色体或基因组中后，这些基因会与寄主生物的遗传物质一起向子代传递，并产生应有的生物学功能基因工程基因工程 “Genetic engineering includes a range of techniques and methods used by scientists to control or modify genes, switch them off or move them between two unrelated species.”一般意义上的基因工程是指一般意义上的基因工程是指““重组重组DNADNA技术技术””或或““基因转移技术基因转移技术””。

基因工程的四要素基因工程的四要素ü目的基因目的基因ü载体载体ü转化方法转化方法ü受体受体–expressed sequence–regulatory sequences–suitable codon usage for the host or target organism–prokaryote v eukaryote–post-transcriptional issues–cell line v germ line transformation重组重组DNA筛选筛选分离外源基因分离外源基因载体载体重组重组转化子转化子整合整合基因工程图解：基因工程图解：转化或转化或转染转染受体细胞受体细胞植物基因工程植物基因工程 植物基因工程具有以下特点： 1）植物基因工程是在基因水平上改造植物的遗传物质，更具有科学性和精确性，同时育种速度也大大加快 2) 植物基因工程能定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性与可操作性 3）植物基因工程大大地扩展了育种的范围，打破了物种之间的生殖隔离障碍，实现了基因在生物界的共用性，丰富了基因资源及植物品种 植物转基因过程A.从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段。

B.将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子C.将重组DNA分子转到适当的植物受体细胞内D.筛选获得了重组DNA的受体细胞，进行繁殖E.基因的表达，产生人类所需要的物质Plant Genetic Engineering ProcessCellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cell 植物基因工程的目的基因Ø抗植物虫害基因（如bt基因）Ø抗植物病毒基因（如cp基因）Ø抗植物真菌病害基因（如几丁质酶基因）Ø抗植物细菌病害基因（如溶菌酶基因）Ø抗非生物胁迫基因（如耐除草剂基因）Ø提高作物产量改良作物品质的基因（如种子贮藏蛋白基因）Ø改良植物其他性状和雄性不育基因（如rol基因、barnase基因）Ø植物医药基因工程转化系统名称转化系统名称载载 体体转化原理转化原理转化方法转化方法受体细胞受体细胞植植物物基基因因转转化化系系统统种质转化系统种质转化系统直接转化系统直接转化系统载体转化系统载体转化系统种质细胞种质细胞茎尖细胞茎尖细胞细胞转化法细胞转化法细细 胞胞生殖细胞生殖细胞花粉粒花粉粒卵细胞卵细胞花粉管通道法花粉管通道法浸浸 泡泡 法法化学原理化学原理物理原理物理原理病毒病毒农杆菌农杆菌PEG法法脂质体法脂质体法激光法激光法超声波法超声波法电泳法电泳法电激法电激法微注射法微注射法基因枪法基因枪法叶盘法叶盘法原生质体共培养法原生质体共培养法共感染法共感染法DNARNARi质粒质粒Ti质粒质粒各各种种受受体体原原生生质质体体植物遗传转化受体类型及特性植物遗传转化受体类型及特性受体受体转化方法转化方法转化率转化率嵌合性嵌合性操作重复性操作重复性愈伤组织愈伤组织基因枪／农基因枪／农杆菌杆菌高高较多较多简单简单组织、器官组织、器官农杆菌农杆菌较低较低有有简单简单原生质体原生质体PEG/PEG/电击电击高高无无复杂复杂生殖细胞生殖细胞花粉管通道花粉管通道低低无无简单简单悬浮细胞悬浮细胞农杆菌农杆菌/电击电击较高较高时有时有较复杂较复杂（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性★★外植体外植体的选择的选择（（植物基因转化受体系统应具备条件） 愈伤组织是在受伤的外植体表面产生的脱分化的无序的分生组织。

胚性愈伤组织则是经由一定的组织（花药、子叶、未发育的胚珠、下胚轴等）在合适的诱导培养基上诱导分化而来，常用于根癌农杆菌介导的遗传转化，如香蕉、柑橘、葡萄、水稻、小麦、棉花等愈伤组织受体系统愈伤组织受体系统特点:Ø外植体试材广泛；Ø扩繁量大,可获得较多的转化植株；Ø通过体胚发生再生植株，嵌合体少；Ø易于接受外源基因,转化率高；Ø转化的外源基因遗传稳定性差；Fig. a–f Transformation of embryogenic calli of cotton and subsequent regeneration. a Embryogenic cotton calli used for transformation. b Enlarged view of embryogenic calli used for transformation. c Co-cultivated cotton calli on selection medium after 6 weeks showing a large number of globular embryo clusters. d Enlarged view of one of the globular embryo clusters from c. e Kanamycin (Km)-resistant transformed cotyledonary embryos on embryo maturation medium. f Km-resistant plants in soil pots in the greenhousePlant Cell Rep (2004) 22:465–470愈伤组织的愈伤组织的分化分化 直接分化再生系统是指外植体细胞不经过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。

用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体,直接分化的研究已取得许多成功的实例直接分化再生系统直接分化再生系统特点:Ø操作简单,周期短;Ø转化的外源基因能实现稳定的遗传;Ø更适于无性繁殖的园艺植物，如果树、花卉及 一些木本植物;Ø转化率低于愈伤组织再生系统;Ø嵌合体较多D. GUS-negative citrange shoot regenerating from a GUS-positive callus.C. GFP-positive and negative shoots regenerating close from the same explants. Molecular Breeding 14: 171–183, 2004.4C, Non-transformed explants regenerated with buds and shoots formed at both ends. Annals of Botany 84: 715±723, 1999外植体的分化外植体的分化• 原生质体是“裸露”的植物细胞,它同样具有全能性,能在适当的条件下诱导出再生植株。

• 从70年代初首次从烟草原生质体成功的培养出再生植株以来,至今已有250多种高等植物的原生质体培养获得成功,其中包括一些重要的禾谷类粮食作物如水稻、小麦、玉米；果树类作物如柑橘、苹果等原生质体再生系统原生质体再生系统特点:Ø原生质体被除去了细胞壁，可直接高效的摄取外源DNA或遗传物质,甚至细胞核；Ø嵌合体更少；Ø易于在相对稳定和均匀的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；Ø适用于各种转化系统；Ø遗传稳定性更差；Ø周期长、难度大、再生频率低(A) Mesophyll protoplasts isolated from GFP transgenic Valencia plant; (B) hybrid colony expressing GFP after 4 weeks culture; (C) hybrid embryoid expressing GFP after 5 weeks culture; (D) hybrid embryoid expressing GFP after 6 weeks culture. Guo WW & Grosser JW. Plant Science 168 (2005) 1541–1545原生质体的转化原生质体的转化 胚状体再生系统胚状体再生系统 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经融合的情况下,模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。

经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体特点:Ø转化率和转化效率都很高；Ø嵌合体少；Ø胚状体具有两极性,可同时分化出芽和根；Ø利用转基因的胚状体可生产人工种子；Ø体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异、小胚的结构完整、成苗快、数量大等优点,有利于转基因植株的生产和推广 Transgenic peach plants (Prunus persica L.) produced by genetic transformation of embryo sections using the green fluorescent protein(GFP) as an in vivo marker. a. Regenerating buds from calli formed on an embryo section after 4 weeks in culture. b. In vitro rooted shoots. Molecular Breeding 14: 419–427, 2004.胚状体胚状体 利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。

小孢子和卵细胞的单倍体培养 胚性细胞或愈伤组织细胞 单倍体植株 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统•采用2-3mm厚的组织薄层（茎段）进行培养，直接诱导芽的分化，获得再生植株•在柑橘上已应用于成年态培养、遗传转化及植物激素与生长发育的关系研究领域薄层细胞受体系统薄层细胞受体系统特点：特点：•试验所需要的材料少；•外植体的生长与培养基的组成关系密切；•通过调节培养基组成，可以从薄层切片上直接诱导芽，勿需经过愈伤阶段，遗传变异相对较少；•周期短，繁殖系数大柑橘薄细胞层柑橘薄细胞层培养培养——图片引自Le Bui VanLe Bui Van等由Tran Thanh Van于1973年提出（Nature 246 (1973) 44-45）★★根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒转化基本程序质粒转化基本程序（1） Ti质粒转化载体的构建（2）受体系统的建立（3）目的基因的转化及转化子再生Agrobacterium tumefaciensTi plasmidAgrobacteriumGenomic DNAPlant cellGenomic DNA (carries the gene of the gene of interestinterest)+Ti plasmid with the gene of interestGene of interestEmpty plasmidRestriction enzyme A ARestriction enzyme A AAgrobacteriumTi plasmid with the new genePlant cellcell’s DNATransgenic plantCell divisionThe new gene+TransformationAgrobacterium tumefaciens 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化★★农杆菌的生物学特性农杆菌的生物学特性农杆菌的生物学特性农杆菌的生物学特性 农杆菌属细菌为格兰氏阴性的土壤杆菌，植物遗传工程载体主要为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogennesis)，分别通过其本身的Ti或Ri质粒完成携带基因从农杆菌到受体的转移。

The Galls Can Be Huge★★根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒的遗传特性质粒的遗传特性 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有200kb组成 Ti质粒根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同可分为：冠瘿碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)★★Ti质粒结构区域质粒结构区域（1）T-DNA区：又称转移DNA，是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA2）Vir区：该区段的基因能激活T-DNA的转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒区3）Con区：该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，以此称之为接合转移编码区4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区 Ti质粒结构示意图质粒结构示意图冠廮碱合成基因(tmt)生长素基因(tms)左边界细胞分裂素基因（tmr）右边界冠廮碱代谢基因Vir基因复 制 起 始 位 点(ori) T-DNA区域★★ T-DNA整合机理整合机理 整整合合机机理理：T-DNA的边界序列对于信号分子的识别和T-DNA的转移是必需的，左右边界25 bp的重复序列被位点特异性的VirD蛋白所识别，该蛋白具有核酸内切酶活性，酶切并释放T-DNA单链，实现DNA的转移。

毒毒性性区区基基因因：Vir区基因，其作用是诱导T-DNA构型的改变、转移、定位插入到核基因组中 （（1）农杆菌对受体的识别；）农杆菌对受体的识别； （（2）农杆菌附着到植物受体细胞；）农杆菌附着到植物受体细胞； （（3）诱导启动毒性区基因表达；）诱导启动毒性区基因表达； （（4）类似接合孔复合体的合成和装配；）类似接合孔复合体的合成和装配； （（5 5））T-DNA的加工和转运；的加工和转运； （（6））T-DNA的整合 农杆菌农杆菌Ti的的T-DNA导入植物基因组整个过程包括：导入植物基因组整个过程包括：农杆菌介导转化的程序Ø外植体的预培养Ø农杆菌菌体的活化Ø侵染Ø共培养Ø转化子的筛选培养Ø转化植株的再生Ø转化子的鉴定外植体预培养外植体预培养菌液制备菌液制备侵染侵染共培养共培养选择培养选择培养分子鉴定分子鉴定田间试验遗传分析性状鉴定田间试验遗传分析性状鉴定整合整合整合整合 外植体的预培养：外植体的预培养：一般以2-3天为宜预培养有利于细胞分裂，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率；驯化作用；减少杂菌污染率；利于外植体与培养基的平整接触 外植体的农杆菌接种：外植体的农杆菌接种：菌液浓度一般为OD600=0.5-0.7之间；浸泡后的外植体要在无菌滤纸上吸干，以除去过量的菌体。

 农杆菌与外植体共培养：农杆菌与外植体共培养：在固体培养基表面加一层滤纸，有利于控制外植体上农杆菌过度增殖共培养时间必须长于16h，一般为2-3天在共培养培养基中加入As(乙酰丁香酮，细胞创伤诱导分子)或采用tomato feeder plates均可提高转化率 外植体脱菌及选择培养：外植体脱菌及选择培养：常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（carbenicillin）、头孢霉素（cefotaxine）及羧噻吩青霉素（timentin）常用的选择抗生素如Km、HPT、bar等•转化植株的再生•转化株的分子鉴定（PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot、实时定量PCR）•转化株的形态、性状观察（株形、分枝、开花结果习性等）•转化株后代遗传分析根癌农杆菌根癌农杆菌Ti质粒转化的方法质粒转化的方法Ø整体植株接种共感染法Ø叶盘转化法Ø原生质体共培养转化法★★农杆菌介导转化的优缺点农杆菌介导转化的优缺点 优点优点：Ø成功率高，效果好；Ø转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且多数符合孟德尔遗传规律；Ø费用低，方法简单易操作；Ø寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都可采用此法，尤其近年来在一些单子叶植物上也取得成功（已有7个科的20多种单子叶植物转化获得成功）。

 不足之处不足之处： 农杆菌介导的转化主要应用于双子叶植物，还有少数的单子叶植物；而大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用；另外，农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来烦恼 PEG介导基因转化介导基因转化 PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸（pLO)、磷酸钙及高PH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子★★PEG介导基因转化法步骤介导基因转化法步骤（1）Ti质粒DNA提取（2）原生质体分离（3）转化培养（4）转化培养同时加入运载DNA（即鲑鱼精DNA或小牛胸腺DNA）（5）离心收集原生质体或用钙离子溶液使PEG逐步稀释（6）将原生质体培养于选择培养基上或不加选择压力按一般方法培养（7）当细胞团长到一定大小时将细胞团转移至含选择压力的培养基中筛选转化细胞★★PEG法的特点法的特点Ø避免嵌合转化体的产生；Ø对细胞伤害少，而且转化顺利；Ø其转化的原生质体易于选择转化体；Ø原生质体转化是理论研究的极好的实验系统；Ø受体植物不受种类的限制。

 PEG法不足之处法不足之处Ø建立原生质体再生系统十分困难，从而阻碍了PEG法的应用；Ø转化率低；Ø从原生质体再生的无性系植株变异较大，因此通过PEG法转化后的转基因植株将产生更多的无性系变异 电击法介导基因转化电击法介导基因转化• 电击法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电击穿孔”（electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取• 此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化 ★★电击法介导基因转化步骤电击法介导基因转化步骤（1）分离原生质体加入电击缓冲液重悬，并离心3分钟去掉上清液，再加入适量的电击缓冲液，计数，将原生质体密度调节到1×106— 2×106个/ml（2）加入10μg/ml质粒DNA和50μg/ml鲑鱼精子DNA，混合后分装于电击反应槽内（3）冰浴5min（4）选择不同参数电击（5）600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤（6）将原生质体包埋于固体培养基中，28℃黑暗条件下选择培养 ★★电击法特点电击法特点 电击法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率较高，特别适于瞬时表达的研究。

缺点是造成原生质体的损伤，使植板率降低，且仪器也较昂贵 基因枪法介导基因转化基因枪法介导基因转化• 基因枪法（particle gun)又称微弹轰击法（microprojectile or biolistic bombardment)最早是由美国康奈尔（Cornell)大学的Sanford等（1987）研制出火药引爆的基因枪• 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得以表达，从而实现基因转化Biolistics Gun  “Gene Gun” TechniqueDNA coated golden particlesGene gunCell divisionA plant cell withthe new geneTransgenic plantPlant cellCell’s DNA★★基因枪法的特点基因枪法的特点 优点：Ø无宿主限制Ø靶受体类型广泛Ø可控度高Ø操作简便快速，甚至可以克服无菌的困难缺点及存在问题：Ø基因枪的硬件设计尚待改善Ø微弹的表面结构、大小、均一性及承载DNA的量及DNA微粒载体的制备技术等Ø特定物种、特定组织、细胞的轰击条件Ø如何诱导更多的细胞同时成为转化和再生感受态是一个非常重要的问题Ø轰击后进入受体细胞的DNA生物学变化及调控等理论问题 花粉管通道法介导基因转化花粉管通道法介导基因转化 是由周光宇等（1983）年建立发展起来的 原理：借助植物自身的生殖细胞（卵细胞或受精卵）为转化对象的直接转化技术，外源基因或DNA可以通过花粉管通道进入受精胚囊，因而称为花粉管通道法（途径）。

使用范围：开花植物  优点：优点： 利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需人工培养过程；方法简便，一般常规育种者易于掌握，成本低，适于普及和使用；单子叶、双子叶植物均可使用，育种时间短 缺点缺点： 这一技术局限于开花时间才能应用；必须有遗传育种和分子遗传学、分子生物学方面的基础知识，才能恰当的进行DNA供受体的组合和判断DNA导入的结果，达到分子育种的目的；应用总DNA片段的导入，筛选到的子代可能带有目的性状基因以外的DNA片段常用基因转化方法特点比较转化方法农杆菌法农杆菌法PEG法法电击法电击法微针注射法微针注射法基因枪法基因枪法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞宿主范围 有无无无无组培条件简单复杂复杂复杂简单嵌合体比例有无无无多操作复杂性简单简单复杂复杂复杂设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵工作效率高低低低高单子叶植物应用少可行可行可行广泛农杆菌的活化农杆菌的活化挑单克隆挑单克隆测OD600收集细胞收集细胞用液体MS培养基重悬细胞将预培养的外植体放入菌液中共培养100rpm,30min取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液共培养在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽诱导芽生长生根，形成转化植株Plant Tissue CultureA Requirement for Transgenic DevelopmentA plant part Is culturedCallusgrowsShootsdevelopShoots are rooted;plant grows to maturity第五节转基因鉴定转基因植物的检测鉴定•外源基因是否进入植物细胞？•进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上？•整合的方式如何？•整合到染色体上的外源基因是否表达？转基因植物的检测鉴定方法•报告基因/标记基因的检测•转基因植物的PCR检测•外源基因整合的Southern杂交鉴定•外源基因转录的Northern杂交检测•外源基因表达蛋白的检测•生物学鉴定报告基因的检测•报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。

•常用的报告基因•NPT-II 新霉素磷酸转移酶基因 抗氨基环醇类抗生素•CAT 氯霉素乙酰转移酶基因 抗氯霉素•HPT 潮霉素磷酸转移酶基因 抗潮霉素•GUS ß-葡萄糖苷酸酶基因 产生蓝色物质•GFP 绿色荧光蛋白基因 产生绿色荧光•LUC 荧光酶素基因 发射光子NPT- ⅡⅡ活性检测活性检测•目的 ：检测Npt-Ⅱ基因在植物组织中的表达•原理： NPT-Ⅱ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活检测时使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移，生成放射性的卡那霉素来检测•检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法•NPT- Ⅱ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放射自显影cat基因活性检测基因活性检测•原理： 氯霉素能与原核细胞50S亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合，抑制蛋白质生物合成。

•cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，可生成1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、1,3-二乙酰氯霉素三种乙酰化产物乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素活性，失去了干扰蛋白质合成的作用•cat基因活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素的生成来测定，常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法gus基因的检测•gus基因编码 ß-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解•检测常用底物有3种： 5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基伞形酮酰- ß-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 对硝基苯-ß-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）•检测方法：组织化学染色定位法X-Gluc 荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG组织化学染色定位法检测组织化学染色定位法检测GUSGUS•以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物水解成蓝色物质，GUSGUS used for promoter analysisgfp基因的检测•绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。

生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况•检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位GFP used forsubcellular localization OSPK1OSPK1蛋白的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位 制备水稻原制备水稻原生质生质将将pUC-OSPK1-GFPpUC-OSPK1-GFP质粒转入原生质质粒转入原生质体中同时也将体中同时也将质粒质粒pUCpUC-GFP-GFP转入转入原生质体中作为原生质体中作为对照对照 培养原生质体培养原生质体 用共聚焦荧用共聚焦荧光显微镜观光显微镜观察，并照相察，并照相 不不含有含有OSPK1OSPK1基因的基因的原生体原生体pUCpUC-GFP-GFP 含有含有OSPK1OSPK1基因的原生基因的原生体体pUC-OSPK1-GFP pUC-OSPK1-GFP 转转化化对对照照质质粒粒的的原原生生质质体体整整个个细细胞胞有有绿绿色色荧荧光光，，而而转转化化含含有有OSPK1OSPK1基基因因质质粒粒的的原原生生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上 GFPGFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果在水稻原生质体中的瞬时表达结果 35S OSPK1 GFP NOS•野生型GFP发射的荧光强度较弱，因此利用突变来寻找强荧光型GFP基因。

•GFP肽链中组成发色团的氨基酸残基发生突变会引起荧光强度的改变•GFPS65T：Ser65变为Thr，在转化的细胞中荧光活性比野生型强18倍萤火虫荧光素酶基因的检测•荧光素酶可以催化生物体自身发光，现在研究较多的是荧火虫荧光素酶及细菌产生的荧光素酶•萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，脱羧后生成激活态的氧化萤光素；细菌萤光素酶以脂肪醛为底物，氧化成为脂肪酸•检测方法：取被检材料置小容器内，加入适量的组织培养液体培养基、ATP、萤光素，置暗室中放置，用肉眼观察荧光或盖以X-光片，观察曝光情况，产生曝光点的样品是转基因成功的•萤光素酶基因是一个灵敏的报告基因,检测的灵敏度比CAT高100倍,而且没有背景，萤光素酶基因的最大特点是不损害植物,即在整体植物或离体器官内,基因产物都可测定，但萤光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累,在植物体内产生光的部位不一定能反映萤光素酶基因的特定表达部位Activity 转基因植物的PCR检测•PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法能在几小时内使pg水平的起始物达到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。

•但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物的Southern杂交外源基因整合的Southern鉴定•Southern杂交技术是1975年发明•原理：利用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化结果•DNA水平Southern杂交法的步骤•提取转基因植物的DNA•限制性内切酶消化•琼脂糖凝胶电泳•碱性溶液中使DNA解离成单链•转膜---凝胶上的DNA区带按原位吸印到膜上•与探针杂交•洗膜•显影外源基因转录的Northern检测•通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到植物染色体上但是，整合到染色体上的外源基因并不一定表达•转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称Northern杂交它是 RNA-DNA异质双链杂交•步骤同Southern杂交法•mRNA水平外源基因表达蛋白的检测•外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因转化的最终目的表达蛋白应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同时应对植物细胞无毒性•外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是经典的方法。

Western杂交•是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的•蛋白质区带-----抗体（同位素标记）•蛋白质水平抗性植株的获得抗性植株的获得抗性抗性愈伤愈伤﹑抗性芽与胚状体获得抗性芽与胚状体获得共共 培培 养养浸浸 染染菌株的获得与活化菌株的获得与活化浸染液的制备浸染液的制备愈伤组织繁殖或播种愈伤组织繁殖或播种愈伤组织或上胚轴制备愈伤组织或上胚轴制备检检 测测柑橘遗传转化程序柑橘遗传转化程序外植体的预培养外植体的预培养 一般以2-3天为宜预培养有利于细胞分裂，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率；驯化作用；减少杂菌污染率；利于外植体与培养基的平整接触外植体的农杆菌接种外植体的农杆菌接种指把农杆菌工程菌株指把农杆菌工程菌株接种到外植体的侵染接种到外植体的侵染转化部位菌液浓度转化部位菌液浓度一般为一般为OD600=0.5-OD600=0.5-1.51.5之间；浸泡后的之间；浸泡后的外植体要在无菌滤纸外植体要在无菌滤纸上吸干，以除去过量上吸干，以除去过量的菌体。

的菌体柑橘上胚轴遗传转化程序柑橘上胚轴遗传转化程序 生殖细胞浸泡法介导基因转化生殖细胞浸泡法介导基因转化 该转化系统是由联邦德国科学家Hess提出浸泡法是将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬浮细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定的整合表达与遗传其原理主要是利用植物细胞自身的物质运转系统将外源DNA直接导入受体细胞 胚囊、子房注射法介导基因转化胚囊、子房注射法介导基因转化 所谓胚囊、子房注射法是指使用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株 许多科学家认为此法是一种简便可行的转化途径，特别对于那些子房大、多胚珠的作物更为适宜 无选择标记基因的转化系统无选择标记基因的转化系统正选择标记系统正选择标记系统：木糖异构酶基因、磷酸甘露糖异构酶基因、异戊烯转移酶（ipt）、发根农杆菌Rol基因 标标记记基基因因的的去去除除：：酵母FLP/FRTs位点特异性重组系统、Zygosaccharomyces rouxii的R/RS系统、噬菌体P1的Cre/lox系统、以及噬菌体Mu的Gin重组酶系统 植物导入外源基因的新途径植物导入外源基因的新途径 －－叶绿体遗传转化叶绿体遗传转化 为减轻目的基因大量表达对植物造成的危害，叶绿体很早已成为外源基因产物的储存场所。

通过在目的基因5’端加上受体植物内源的导肽序列，利用核转化就可将基因的产物定位于叶绿体 将外源基因导入叶绿体的方法将外源基因导入叶绿体的方法Ø农杆菌介导法（Venkateswarlu and Nazar，1991）ØPEG法（Kofer et al,1998)Ø显微注射法(Schnorf et al,1994)Ø玻璃珠法(Kindle et al,1991)Ø电激法(Rao et al,1995)其中农杆菌介导法成功例证极少，迄今为止仅有两例，PEG法、电激法至今未能获得稳定的转化体，玻璃珠法无法应用于高等植物，显微注射法近期有较大改进，但距用于高等植物仍有一定距离目前基因枪转化法是应用广泛的叶绿体转化方法优点：Ø超量表达目的基因；Ø以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默；Ø具原核表达方式，能以多顺反子的形式表达多个基因；Ø母系遗传方式可防止基因扩散；Ø基因产物区域化并能提供适于某些产物发挥功能的小环境等 本节完，谢谢！。