流式细胞术及其科研应用课件.ppt

流式细胞术流式细胞术及其科研及其科研(kē yán)(kē yán)应用应用第一页，共一百零五页流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理(yuánlǐ)(yuánlǐ)第二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry, Flow Cytometry, 简称简称FCMFCM））是一种可以快是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成(rén ɡōnɡ hé chénɡ)(rén ɡōnɡ hé chénɡ)微球等微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量第三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的特点流式细胞术的特点(tèdiǎn)v极短时间内可分析大量极短时间内可分析大量(dàliàng)(dàliàng)细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（细胞仪（Flow cytometerFlow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个 v可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确别、计数更为准确v定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNADNA含量、含量、抗原或受体表达量、抗原或受体表达量、CaCa2+2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析单细胞水平的定性与定量分析 v强大的分选功能，在分析的强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选第四页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测流式细胞仪的检测(jiǎn cè)(jiǎn cè)范围范围细胞细胞(xìbāo)(xìbāo)结构结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核的特异核的特异性抗原性抗原(kàngyuán)(kàngyuán)=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体第五页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function当前当前(dāngqián)流式细胞分析发展趋势流式细胞分析发展趋势v从相对从相对(xiāngduì)(xiāngduì)细胞计数到绝对细胞计数细胞计数到绝对细胞计数 v从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析v从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析 v从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析v从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析 第六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号(xìnhào)(xìnhào)Right Angle Light Detector   Cell ComplexitySSCForward Light Detector   Cell Surface Area FSCIncident Light Source=前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter））细胞相对大小细胞相对大小(dàxiǎo)(dàxiǎo)及其表面积及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter））细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALS Sensor第七页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function外周全血细胞散射光双参数外周全血细胞散射光双参数(cānshù)(cānshù)点点图图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）第八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测流式细胞仪的检测(jiǎn cè)(jiǎn cè)信号信号荧光信号荧光信号•使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析•荧光信号的强弱荧光信号的强弱(qiánɡ ruò)(qiánɡ ruò)，反映了细胞抗原的表达含量，反映了细胞抗原的表达含量第九页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function荧光荧光(yíngguāng)(yíngguāng)信号信号双色直接双色直接(zhíjiē)染色染色第十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=直方图分析直方图分析(fēnxī)第十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=点图分析点图分析(fēnxī)第十二页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=等高图和密度等高图和密度(mìdù)图图分析分析第十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=三维图分析三维图分析(fēnxī)(fēnxī)第十四页，共一百零五页流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用(yìngyòng)(yìngyòng)第十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function•临床研究临床研究: :ð 血液、肿瘤、药理、免疫(miǎnyì)….•生物学研究：生物学研究：ð遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、….•环境研究：环境研究：ð海洋生态研究….•制药工业制药工业•食品工业食品工业•农业畜牧业农业畜牧业流式细胞仪的应用领域流式细胞仪的应用领域第十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床流式细胞仪的临床(lín chuánɡ)(lín chuánɡ)应用应用( (免疫免疫) )Ø淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD4CD4绝对计数绝对计数ØHIVHIV的诊断与研究的诊断与研究淋巴细胞淋巴细胞 CD4/CD8CD4/CD8分析分析CD4CD4绝对计数绝对计数T T细胞活化细胞活化Ø细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测Ø免疫功能和免疫调控免疫功能和免疫调控(diào kònɡ)(diào kònɡ)的研究的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测细胞因子的检测ØHLA-B27HLA-B27检测检测第十七页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床流式细胞仪的临床(lín chuánɡ)(lín chuánɡ)应用应用( (血液血液) )Ø白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型Ø残留白血病残留白血病Ø造血干细胞计数造血干细胞计数ØPNHPNH诊断诊断Ø网织红细胞分析网织红细胞分析Ø血小板分析血小板分析•血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达(biǎodá)(biǎodá)•血小板活化血小板活化•网织血小板分析网织血小板分析第十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床流式细胞仪的临床(lín chuánɡ)(lín chuánɡ)应用应用( (肿瘤肿瘤) )Ø细胞周期分析细胞周期分析uDNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志u在在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息uDNA非整倍体的交界瘤应按恶性非整倍体的交界瘤应按恶性(è xìng)对待对待u形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能uDNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标Ø多药耐药基因的检测多药耐药基因的检测第十九页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的科研流式细胞仪的科研(kē yán)(kē yán)应用应用=树突细胞树突细胞(xìbāo)(xìbāo)研究研究=干细胞研究干细胞研究=细胞凋亡细胞凋亡=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究第二十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析(fēnxī)(fēnxī)•根据根据(gēnjù)(gēnjù)功能，淋巴细胞主要分为功能，淋巴细胞主要分为ðB B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关ðT T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关•总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 ðNKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能，，  能能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。

作用第二十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析(fēnxī)(fēnxī)ð根据根据CD4CD4、、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为ðT T辅助辅助/ /诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+））ðT T抑制抑制/ /细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+））ðTh/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHDGVHD的攻击的攻击 Th/TsTh/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE）） Th/TsTh/Ts降低降低(jiàngdī)(jiàngdī)：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血第二十二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化(biànhuà)(biànhuà)：：•疾病疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ •类风湿性关类风湿性关节炎节炎   （活动期）（活动期）     •系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮 - 或或  （活动期）（活动期）       •多发性硬化症多发性硬化症   •重症肌无力重症肌无力     •膜型肾小球肾炎膜型肾小球肾炎     •胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病     •乙型肝炎乙型肝炎  •自身溶血性贫血自身溶血性贫血(pínxuè)(pínxuè)     •上呼吸道感染上呼吸道感染      第二十三页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function常见疾病的常见疾病的T T 淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化(biànhuà)(biànhuà) CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 肿瘤肿瘤(zhǒngliú)(zhǒngliú)                 再障及粒细胞减少症再障及粒细胞减少症      巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染       血小板减少血小板减少             活动性特应性皮炎活动性特应性皮炎        过敏性皮炎过敏性皮炎        第二十四页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析(fēnxī)(fēnxī)12%76%49%26%11%第二十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionAIDS 病人病人(bìngrén)T亚群亚群分析分析27-51%15-44%50-84%第二十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症5-18%第二十七页，共一百零五页淋巴细胞淋巴细胞活化活化(huóhuà)功能研究功能研究第二十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionT淋巴细胞活化淋巴细胞活化(huóhuà)•细胞数目增殖细胞数目增殖•细胞表面表达细胞表面表达(biǎodá)(biǎodá)活化标记活化标记•分泌细胞因子分泌细胞因子第二十九页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionT细胞激活抗原表达细胞激活抗原表达(biǎodá)的动力学的动力学曲线曲线第三十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function活化活化(huóhuà)的淋巴细胞分泌细胞的淋巴细胞分泌细胞因子因子第三十一页，共一百零五页。

FastImmune Assay System快速全面检测快速全面检测(jiǎn cè)(jiǎn cè)淋巴细胞淋巴细胞功能功能 第三十二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionBD FastImmune Activation System快速快速(kuài sù)免疫活化检测系统免疫活化检测系统lymphocyte Activation        4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus第三十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function优优点点快速快速全程全程<5h简简便便●全血分析全血分析（（肝素肝素钠钠抗凝血抗凝血））●无需分离无需分离PBMCs●无需无需组织组织培养培养●免洗免洗试剂试剂，无需洗，无需洗涤涤离心离心高效高效●多参数分析加速研究多参数分析加速研究进进程程●功能活性功能活性检测检测同同时报时报告告单单个个细细胞胞亚亚型型可外延可外延●T细细胞分析可胞分析可进进行行亚亚群分析群分析●可外延于可外延于B、、NK、、单单核核细细胞胞接近生物体接近生物体自身分析条件自身分析条件●应应用全血保留了用全血保留了细细胞与生化微胞与生化微环环境境●更能代表体内状更能代表体内状态态BD FastImmune Activation System快速快速(kuài sù)免疫活化检测系统免疫活化检测系统第三十四页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function应应用用(yìngyòng)(yìngyòng)实实例例：：HIVHIV病病例例T T细细胞胞活活化化检测检测第三十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionBD FastImmune Cytokine System快速免疫快速免疫(miǎnyì)细胞因子检测系统细胞因子检测系统 Anti–IFN–gCD69 Activation 37℃ IncubationIntracellular StainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurface StainWashcytokineWashWashprotein blocking•基基于于细细胞胞水水平平(shuǐpíng)的的研究研究•胞内因子胞内因子•胞外因子胞外因子第三十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function优优点点快速快速一天内完成，实验流程需6-8小时简简便便●全血分析全血分析（（肝素肝素钠钠抗凝血抗凝血））●无需分离无需分离PBMCs●无需无需组织组织培养培养高效高效●可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子●也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，进行多参数相关分析进行多参数相关分析接近生物体接近生物体自身分析条件自身分析条件●应应用全血保留了用全血保留了细细胞与生化微胞与生化微环环境境●更能代表体内状更能代表体内状态态注意注意● 质控：用质控：用CD69做刺激和破膜效果的判定做刺激和破膜效果的判定BD FastImmune Cytokine  System快速快速(kuài sù)免疫细胞因子检测系统免疫细胞因子检测系统第三十七页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function应用实例：分析应用实例：分析1型与型与2型免疫型免疫(miǎnyì)反反应应第三十八页，共一百零五页Cytometric Beads Array (CBA)流式液相多重蛋白流式液相多重蛋白定量定量(dìngliàng)技术技术第三十九页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function导言导言(dǎoyán)•常规的蛋白分析方法：常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标：一次反应只能检测一个指标Western blot：不能对蛋白精确定量：不能对蛋白精确定量不足之处：不足之处：Ø检测多个指标需耗费大量样本检测多个指标需耗费大量样本Ø分批操作导致组间差异大分批操作导致组间差异大Ø操作繁琐，耗时耗力操作繁琐，耗时耗力•如何如何(rúhé)能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？得高精确度的数据呢？•针对于此，针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术技术——BD Cytometric Bead Array，简称，简称CBA   第四十页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionCBACBA技术技术(jìshù)(jìshù)简简介介•CBA是是一一系系列列带带有有不不同同强强度度红红色色荧荧光光、、包包被被有有捕捕获获抗抗体体的的微微球球，，类类似似ELISA的的捕捕获获孔孔板板，，可可以以捕捕获获液液相相样样本本（（血血清清、、血血浆浆或或者者细细胞胞培培养养上上清清液液等等））中中相相应应的的抗抗原原，，再再结结合合(jiéhé)PE标标记记检检测测抗抗体体，，形形成成双双抗抗体体夹夹心心结结构构，，通通过过流流式式细细胞胞仪仪进进行行荧荧光光检检测测，，便便可可同同时时对对样样本本中中的的多多种种可可溶溶性性蛋蛋白白成分进行定量成分进行定量++Analyte of interestFluorescent detection Ab capture Bead capture AbBead第四十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionBD Cytometric Bead Array123不同强度红色荧光不同强度红色荧光(yíngguāng)的捕获微球，的捕获微球，在在FCM FL3检测检测不同的目标不同的目标(mùbiāo)蛋白蛋白PE 标记的检测抗体，在标记的检测抗体，在FCM FL2检测。

检测 PE的荧光强度即反映靶蛋的荧光强度即反映靶蛋白白(dànbái)的含量的含量456第四十二页，共一百零五页Human Th1/Th2 Lymphokine CBA第四十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA•Th1/Th2 panel: IL2, IL4, IL5, IL10, TNF, IFN•用 FL3荧光(yíngguāng)的强度不同区别 种不同的微球（beads）•Direct sandwich immunoassay•FL2 (PE) detector reagentl样本处理l6 cytokines from a 50 L samplelThree pipetting stepsl3 hour total incubationlQuantitative results and complete report generation•Software assisted quantitative analysis, with curve fitting algorithm•Result reporting included in software第四十四页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA第四十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionHuman Th1/Th2 Cytokine CBA Kit•No sample added in•Detector antibodies only第四十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function Chemokine-I CBA Assay Standard0 pg/mlCBA Assay Standard     第四十七页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function10 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function20 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第四十九页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function40 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function80 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function156 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function312 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function625 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十四页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function1250 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function2500 pg/mlCBA Assay Standard cont. cont.Chemokine-I CBA Assay Standard第五十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionHuman Th1/Th2 Lymphokine CBA –标准标准(biāozhǔn)曲线曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- IL-2IL-4IL-5IL-10TNF- IFN- 第五十七页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function操作步骤操作步骤•检测物与捕获微球共检测物与捕获微球共孵育孵育。

•洗涤洗涤•标记标记荧光探测试剂（荧光探测试剂（FITC或或PE标记）•洗涤洗涤•流式细胞仪上机流式细胞仪上机检测检测•CBA分析软件分析软件(ruǎn jiàn)批量数据分析批量数据分析第五十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionCBA 分析分析(fēnxī)软件软件Home ScreenToolbarCalibration entry screen第五十九页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function与传统的与传统的ELISAsELISAs检测检测(jiǎn cè)(jiǎn cè)相比相比•能够同时对单一样本能够同时对单一样本(yàngběn)进行多种目的蛋白检测进行多种目的蛋白检测•较传统检测节省样本量（较传统检测节省样本量（50μl））•与与ELISAs相比灵敏度高（相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好）、重复性好•检测的线性范围宽（检测的线性范围宽（0-5000pg/ml））•所有分析只需一组标准曲线所有分析只需一组标准曲线•避免酶联反应所致人工假象避免酶联反应所致人工假象•强大的强大的CBA分析软件分析软件•节省操作时间、检测时间和分析时间节省操作时间、检测时间和分析时间第六十页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionHuman Allergy Mediator Kit第六十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function•使用使用Prostate-specific antigen（（PSA-3）及其突变体）及其突变体PSA-3A对前列腺癌患者对前列腺癌患者T细胞免疫，通过细胞免疫，通过Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit检测检测(jiǎn cè)免疫免疫T细胞的细胞因子分泌水平细胞的细胞因子分泌水平•A，，B，，C为稀释标准，为稀释标准，D为无处理对照组，为无处理对照组，E为为PSA-3A处理组，处理组，F为为PSA-3处理组处理组•摘自摘自Terasawa H, et al. Clinical Cancer Research.Vol.8,41-53, January 2002•上述研究发现上述研究发现PSA-3A比比PSA-3能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与PSA-3A能刺激能刺激T细胞分泌更高水平的细胞分泌更高水平的IL-2、、IL-4、、IL-5和和IFN-γ有关，为后续药物开发打下基础有关，为后续药物开发打下基础第六十二页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionCBA新产品新产品(chǎnpǐn)系列－系列－CBA Flex Set•基本原理与基本原理与CBA Kit相似，略有不同相似，略有不同•检测原理检测原理(yuánlǐ)：：Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，通过（红色荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而鉴定目的蛋这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而鉴定目的蛋白，白，PE标记的检测抗体在标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量通道来对目的蛋白定量new第六十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionCBA Flex Set的分析的分析(fēnxī)软件软件－－ FCAP Array Software第六十四页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionCBA Kit与与CBA Flex SetCBA Kit•同时检测同时检测5、、6或者或者(huòzhě)7个个•全部试剂全部试剂•CBA Analysis Software•检测指标组合固定检测指标组合固定CBA Flex Set•最多达最多达75个个•需另购需另购Buffer kit•FCAP Array Software•检测检测(jiǎn cè)指标可自由组合指标可自由组合第六十五页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionCBA/CBA Flex set的应用领域的应用领域•血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等各种液相样本中可溶性细胞因子、炎症因子、趋化因子、酶等的浓度检物等各种液相样本中可溶性细胞因子、炎症因子、趋化因子、酶等的浓度检测测•细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析 •免疫疾病或传染疾病（如眼部疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑免疫疾病或传染疾病（如眼部疾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、新生儿溶血症及脓血症、病毒性感染等）的辅助诊断和监控狼疮、新生儿溶血症及脓血症、病毒性感染等）的辅助诊断和监控•肿瘤研究肿瘤研究•药效评价，药物研发、疫苗药效评价，药物研发、疫苗(yìmiáo)(yìmiáo)研究研究•总体免疫功能分析总体免疫功能分析第六十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function现有现有(xiàn yǒu)CBA Kit产品产品Human Allergy Mediator KitIL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, GM-CSFHuman Allergy Mediator Kit IIIL-3, IL-4, GM-CSF, G-CSF, EotaxinHuman Anaphylatoxin KitC4a, C3a, C5aHuman Angiogenesis KitIL-8, bFGF, Angiogenin, VEGF, TNFHuman Chemokine KitIL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10Human Chemokine Kit IIIL-8, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1Human Inflammation KitIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-gHuman Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation KitIL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNFNon-human Primate Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-gHuman Apoptosis KitCleaved PARP, Bcl-2, Active Caspase-3Mouse Immunoglobulin Isotyping KitHeavy and light chain isotypes of mouse IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgEHuman Inflammation Lyophilized StandardsIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation Lyophilized StandardsIL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF第六十七页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function信号传导类信号传导类细胞因子类细胞因子类磷酸化蛋白磷酸化蛋白人人 小鼠小鼠 大鼠大鼠ERK (T202/Y204) JNK (T183/Y185)p38/MAPK (T180/Y182)PLC-gamma (Y783)ZAP70 (Y319)Syk (Y352)Stat1 (Y701)Btk (Y551)RSK (T573)Itk (Y511)eNos (S1177)ZAP70（（Y319））Total SykTotal Stat1IFN-γIL-2IL-4IL-5IL-6IL-8IL-10IL-1βIP-10IL-12p70LT-αMIGMCP-1MIP-1 βTNFIFN- γIL-2IL-4TNFIL-10IL-6IL-5IL-12p70 IFN- γIL-4TNFIL-10IL-6 现有现有(xiàn yǒu)CBA Flex Set产品产品第六十八页，共一百零五页树突状细胞树突状细胞(xìbāo)（（Dendritic Cell，，DC））第六十九页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionDC的分化的分化(fēnhuà)和成和成熟熟•DC可分为可分为前体前体DC，，未成熟未成熟DC，，成熟成熟DC•DC起源于骨髓起源于骨髓CD34+多能细胞，多能细胞，在在GM-CSF作用下，进一步分化为作用下，进一步分化为DC前体细胞，前体细胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进入外周血包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进入外周血•在在外周血中至少有两种外周血中至少有两种DC前体被鉴定出来：前体被鉴定出来：     Plasmacytoid DC——PDC——浆细胞样的树突细胞浆细胞样的树突细胞     Myeloid DC——MDC——髓样的树突细胞髓样的树突细胞•血液中的前体血液中的前体DC随血液迁移到随血液迁移到皮肤、胃肠道、心、肝、肺等非淋巴器官发皮肤、胃肠道、心、肝、肺等非淋巴器官发育为未成熟育为未成熟DC•未成熟未成熟DC摄取外来抗原后，可自发摄取外来抗原后，可自发(zìfā)成熟，由外周向次级淋巴器官归巢成熟，由外周向次级淋巴器官归巢•在成熟过程中，在成熟过程中，DC摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈抗原摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈抗原的功能逐渐增强的功能逐渐增强第七十页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionA review of Jacques Banchereau第七十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function树突状细胞树突状细胞(xìbāo)的可塑的可塑性性•DC在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化 •DC分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些组织中担分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些组织中担当当(dāndāng)起对抗入侵感染因素的哨兵起对抗入侵感染因素的哨兵第七十二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionDC的表面的表面(biǎomiàn)标志标志•人人DC的主要特征性表面标志为的主要特征性表面标志为CD1a和和CD83，，CD83还是还是DC充分成熟的标志充分成熟的标志•成熟成熟DC高表达高表达CD80（（B7-1），），CD86，，CD40和和CD54等共刺激等共刺激(cìjī)分子，而未分子，而未成熟成熟DC不表达或低表达这些分子不表达或低表达这些分子•未成熟未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体•所有所有DC共同的突出特点是能高水平表达共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如类分子如HLA-DR，，DC成熟过成熟过程突出的标志是程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面。

胞膜表面 第七十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function人外周血人外周血DC亚群的鉴定亚群的鉴定(jiàndìng)•PDC：：linnegCD11cnegCD123high；；MDC：：linnegCD11chighCD123low •二者还都高表达二者还都高表达(biǎodá)MHC-Ⅱ（（HLA-DR），但都不表达），但都不表达lin（（CD3，，CD14，，CD16，，CD19，，CD20，，CD56））注：注：CD11c：整合素：整合素αx链链 CD123：：IL-3受体受体α链链第七十四页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionDC体外诱导体外诱导(yòudǎo)分分化化第七十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function监控监控(jiān kònɡ)DC成熟度成熟度•BD™ Multicolor MDDC phenotyping reagentðCD209 (DC-SIGN)：：DC独有独有(dú yǒu)标志标志ðCD83：充分成熟标志：充分成熟标志ðCD86：：DC成熟过程中表达增加成熟过程中表达增加第七十六页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function小鼠小鼠DC•小鼠小鼠DC的标志是的标志是CD11c，成熟，成熟DC也有也有MHC-Ⅱ和和CD80，，CD86的表达的表达•小鼠小鼠DC前体主要分为两类：功能前体主要分为两类：功能(gōngnéng)上等同于人上等同于人MDC和和PDC•小鼠小鼠DC制备：小鼠骨髓制备：小鼠骨髓ðBD™ IMag Mouse Dendritic Cell Enrichment Set•大鼠大鼠DC：常用标志：常用标志OX62，，OX6（（MHC-Ⅱ），），CD80，，CD86等等第七十七页，共一百零五页细胞凋亡细胞凋亡(diāo wánɡ)(diāo wánɡ)检测检测第七十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)(xìbāo)凋亡的凋亡的分析分析•细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程•细胞凋亡的主要检查手段细胞凋亡的主要检查手段ð形态学检查形态学检查ðDNA Ladders实验实验ð流式细胞仪检查流式细胞仪检查•与凋亡相关的病理过程与凋亡相关的病理过程ðHIVð自身免疫性疾病自身免疫性疾病(jíbìng)ð肿瘤肿瘤第七十九页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function细胞凋亡细胞凋亡(diāo wánɡ)(diāo wánɡ)的的分析分析•细胞凋亡的主要表现细胞凋亡的主要表现(biǎoxiàn)ð细胞内水解酶改变：如细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化活化ð细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：膜的完整性：Annexin V/PIð细胞核细胞核DNA的断裂改变：的断裂改变：TUNNEL实验（实验（APO-BRDU，，APO-DIRECT））•凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白：ðFasðBcl-2第八十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——PI分析分析PI - Fluorescence# Events凋亡凋亡(diāo wánɡ)细胞细胞正常正常(zhèngcháng)G0/G1期细胞期细胞第八十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——Active Caspases-3第八十二页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——Caspases-3第八十三页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——Annexin ⅤⅤ 第八十四页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——Annexin ⅤⅤ第八十五页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function凋亡凋亡(diāo wánɡ)(diāo wánɡ)检测（检测（Annexin V/PIAnnexin V/PI法）法） PIAnnexin V-FITCAnnexin V-FITC第八十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function凋亡凋亡(diāo wánɡ)(diāo wánɡ)检测（检测（BrdUBrdU法）法） 第八十七页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function细胞细胞(xìbāo)凋亡凋亡——BrdU第八十八页，共一百零五页 流式分选流式分选 与与分分子子生生物物学学研研究究(yánjiū)(yánjiū)第八十九页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function流式分选与分子生物学研究流式分选与分子生物学研究(yánjiū)(yánjiū)•除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，除了将分选得到的细胞进行后续培养研究外，FCMFCM分选系统可为分选系统可为PCRPCR、、FISHFISH等分子技术提供纯等分子技术提供纯度度(chúndù)(chúndù)较高的特异性细胞群，减少研究中的干较高的特异性细胞群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果扰因素，获得更准确的实验结果第九十页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function流式与分子生物学流式与分子生物学-FISH •以流式细胞仪分选目的细胞以流式细胞仪分选目的细胞•分选后的细胞进行分选后的细胞进行FISHFISH•右图显示未分选前混合细胞右图显示未分选前混合细胞•较小的较小的PBMCsPBMCs显示有两个红色斑点显示有两个红色斑点( ( X X探针探针(tàn zhēn)(tàn zhēn)) )，较大的，较大的DaudiDaudi细胞显示有一个红色斑点及一个细胞显示有一个红色斑点及一个绿色斑点绿色斑点。

第九十一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function分选后的细胞分选后的细胞(xìbāo)进行进行FISH第九十二页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function分选后细胞进行分选后细胞进行(jìnxíng)PCR分析分析第九十三页，共一百零五页流式流式&干细胞研究干细胞研究(yánjiū)SP细胞细胞(xìbāo)第九十四页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function为什么要研究为什么要研究(yánjiū)干细胞干细胞•干细胞替代治疗ð治疗血液疾病的骨髓移植、脐带血移植比较成熟ð应用骨髓干细胞移植治疗心肌梗死和血管性疾病 ð骨髓间充质干细胞等对神经系统疾病、糖尿病的治疗作用已在动物模型中取得一定进展•药物(yàowù)筛选ð利用干细胞的分化潜能体外构建各种组织模型，通过基因修饰等手段研究药物作用靶点，毒理、药理等•发育生物学基础理论研究ð通过gain-of-function和loss-of-function研究基因在分化、发育中的功能ð借助体细胞核转移技术建立各种疾病的干细胞模型研究疾病成因及治疗途径第九十五页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune FunctionSP细胞的鉴定细胞的鉴定(jiàndìng)和分离和分离•大部分大部分SP细胞保持原始细胞的细胞保持原始细胞的c-kit＋＋Sca-1＋＋Lin－－表型Nakauchi等研究认为，等研究认为，CD34low/－－c-kit＋＋Sca-1＋＋Lin－－细胞和细胞和SP细胞有一个很大的交叉，而长期的骨髓造血活性只发现细胞有一个很大的交叉，而长期的骨髓造血活性只发现在在CD34low/－－c-kit＋＋Sca-1＋＋Lin－－的细胞•SP细胞群缺乏明确的细胞群缺乏明确的Marker，利用流式细胞仪检测其对活，利用流式细胞仪检测其对活细胞染料细胞染料Hoechst 33342的染色排斥是目前最准确和推荐的的染色排斥是目前最准确和推荐的鉴定方法，用该染料活染鉴定方法，用该染料活染SP细胞时，经紫外激发表现为细胞时，经紫外激发表现为Hoechst 33342双波长双波长(bōcháng)荧光阴性或弱阳性的细胞群体，荧光阴性或弱阳性的细胞群体，能与非能与非SP细胞区分细胞区分第九十六页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionHoechst染色染色(rǎnsè)的的C57Bl/6小鼠的全骨髓小鼠的全骨髓细胞细胞Hoechst单染单染Hoechst/PI双染双染第九十七页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function流式鉴定流式鉴定(jiàndìng)小鼠骨髓和小鼠骨髓和CD34富集的人脐血富集的人脐血中的中的SP细胞细胞——摘自摘自Flow Cytometry Protocols （第二（第二(dì èr)版）版）第九十八页，共一百零五页BD BiosciencesImmune FunctionHoechst 33342染色的小鼠骨髓染色的小鼠骨髓(ɡǔ suǐ)中中SP表型和表型和HSCs表面抗原表达的关系表面抗原表达的关系•右图显示的是右图显示的是KLS (c-Kit＋＋Lin－－Sca-1＋＋) 细胞细胞(xìbāo)，可见，可见KLS细胞在细胞在SP区域内区域内高度富集高度富集——摘自摘自Flow Cytometry Protocols （第二（第二(dì èr)版）版）第九十九页，共一百零五页流式细胞仪的流式细胞仪的其它其它(qítā)(qítā)应用应用第一百页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function酶活力酶活力(huólì)的测定的测定 第一百零一页，共一百零五页BD BiosciencesImmune Function动力学研究动力学研究(yánjiū)(yánjiū)- - 钙离子检测钙离子检测第一百零二页，共一百零五页。

BD BiosciencesImmune Function流式网络资源流式网络资源=关键词搜索关键词搜索(sōu suǒ)：：FCM，，FACS，流式，流式==（中文）（中文）第一百零三页，共一百零五页谢谢谢谢(xiè xie)！！第一百零四页，共一百零五页内容(nèiróng)总结流式细胞术及其科研应用从细胞膜成分到细胞内成分分析在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息Anti–IFN–应用实例：分析1型与2型免疫反应标记(biāojì)荧光探测试剂（FITC或PE标记(biāojì)）细胞凋亡——Active Caspases-3细胞凋亡——Caspases-3谢谢第一百零五页，共一百零五页。