实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质.ppt

实验二、葡聚糖凝胶柱层析1、目的与要求：、目的与要求：　1.1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；　1.2、 掌 握 葡 聚 糖 凝 胶 （ Sephadex） 柱 层 　 　 　析的操作技术2、概述及原理：、概述及原理：　凝胶　　是一类不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能，具有立体网状结构的物质（如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等） 2.1、能用于层析的凝胶主 要有下面几种：　目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE- Sephadex）等种类 交联葡聚糖凝胶 ：　是凝胶层析法中使用最广泛的一类层析凝胶，商品名称：SephadexSephadex其基本骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖残基通过α－1，6糖苷键连接而成，葡聚糖分子之间通过醚桥（甘油基）交联形成三维空间网状结构 2.2、不同型号的葡聚糖凝胶　(Sephadex) 的选用原则： 　　 组别分离时，Sephadex G－25最为常用。

例如样品中缓冲液的更换，蛋白质的脱盐 ； 分级分离时（如多蛋白质组分样品的分离纯化），应根据待分离样品中各组分的分子量大小和分子量分布范围来确定型号 　2.3、凝胶层析法的原理：　凝胶层析凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应当洗脱开始以后，小分子可进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应 层析柱的重要参数 ： 　　Vt(total volume)　 Vo(outer volume)　　Vi(inner volume)　 Ve(elution volume) 　　Vg(gel volume) 　　Vt=Vo+Vi+Vg , 　　Ve=Vo+Kd×Vi组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的体积很少时（与洗脱体积比较可以忽略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve ②当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置③当样品体积很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处） Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。

Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi几个特征Kd值意义：　　 ①Kd=0,则Ve=Vo ，全排阻；　　 ②Kd=1,则Ve=Vo+Vi , 全掺入；　　 ③0＜Kd<1,则Ve=Vo+Kd×Vi ，部分掺入；　　 ④Kd>1，则Ve>Vo+Vi ，如某些芳香族化　　　　　合物（Phe,Tyr,Trp等），Sephadex G-25对它们有吸附作用 　　　　　2.4、影响凝胶层析分离的因素：　　2.4.1、样品的体积、粘度； 　　2.4.2、层析柱 ；　　2.4.3、洗脱液流速的影响 ；　　2.4.4、洗脱液离子强度、PH的影响 2.4.1、样品的体积、粘度： 分析分离时，Vsample=1-4%Vbed； 制备分离时，Vsample=10-30Vbed. 相对粘度 　样品液粘度与洗脱液粘度的比值分离效果只与相对粘度有关，一般来说，相对粘度不得超过1.5―2 今天的上样量（0.4ml）约为1%柱床体积2.4.2、层析柱： 　①柱长：组别分离时，20－30厘米；　　　　　分级分离时，可长至100厘米；　②柱径：柱长与柱径的比为5:1─10:1(脱盐)，20:1─100:1 (纯化) 。

　今天选用的是1cm ×30cm的层析柱2.4.3、洗脱液流速的影响： 洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关流速过快，会使色谱峰变形，　流速过慢，样品扩散倾向加剧　一般流速控制在30－200ml/h 　 今天洗脱流速控制在1ml/min2.4.4、洗脱液的离子强度和pH值的影响： 纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和消除凝胶的吸附作用；酸性组分应选用偏碱性洗脱液；碱性组分应选用偏酸性洗脱液2.5、凝胶层析法的应用：　1、生物分子的分离提纯； 　2、测定高分子物质的分子量 ；　3、脱盐工具； 4、高分子溶液的浓缩 ；　5、用于去除热原物质 2.6、凝胶的防腐、保存： Sephadex、Sepharose等都是多糖类物质，易于长菌，因此常在凝胶（不用时）中加入抑菌剂，使用时再除去常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂1厘 米 光 程 时 ， 254nm处 透 光 率 为 60％ ， 　　　　　　 280nm处透光率为100％3、试剂、器材：、试剂、器材：　3.1、层析介质　　 Sephadex G-50；　3.2、样品（包含三个组分）：　　　　　　　　　　　　　①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp 　　上样量：0.4ml/柱。

　3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水　3.4、层析系统：层析柱、恒流泵、部分收集器、核酸蛋白检测仪、记录仪 　　　　　　4、实验操作过程：、实验操作过程：　4.1、凝胶的溶胀　4.2、装柱；　4.3、上样； 　4.4、洗脱和收集 　4.1、凝胶的溶胀： 　将称好的凝胶干粉投入烧杯中，加以适量洗脱液，沸水浴溶胀2小时（也可室温24小时）　沸水浴溶胀的好处：省时，还可消毒，　　　　　　驱除凝胶颗粒内部的气泡 4.2、装柱： 　　①流程： 4.2、装柱： ②装柱：　干净的层析柱调整固定在垂直状态，柱内装放适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡，关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液，加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液调节流速1ml/min床面上覆盖尼龙膜或滤纸（对操作熟练者不需要而且不放更好）4.3、上样： 上样前柱子要平衡打开上接头，用吸管吸去床面上大部分洗脱液，当洗脱液面接近凝胶床面时，关闭层析柱出口端，用吸管吸取样品混合液0.4毫升，沿管壁小心加样于柱床表面，打开层析柱出口端，待样品完全掺入胶内，开始收集流出液，同时小心加满洗脱液，连接好层析柱上接头，通过泵控制流速：1ml/min。

样品中组分的分子量差异特别大，颜色也不一样，可使同学们直观地观察到层析分离过程4.4、洗脱和收集： 流速1ml/min不变，3ml/tube收集流出液，核酸蛋白检测仪的灵敏度定在0.2，记录仪纸速6cm/h，电压50mV，部分收集器：3min/tube　　最后，根据记录的实验结果，计算层析　 　 　 柱的Vo、Vi以及样品的Ve、Kd。