内毒素检测进展教学文稿.ppt

内毒素检测进展 内内毒毒素素（（Endotoxin, ET））是是革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌细细胞胞壁壁的的主主要要成成分分，，其其化化学学成成分分为为脂脂多多糖糖（（Lipopolysaccharide，，LPS）），，由由类类脂脂A、核心寡聚糖、核心寡聚糖O及多糖侧链组成及多糖侧链组成2TNF、、IL-1IL-6、、IL-8瀑布样反应，全身炎性反应综合症瀑布样反应，全身炎性反应综合症急性炎症急性炎症PG、、TXA、、LTC、、PAG、、C5a、、O2-、、NO，弹力酶，弹力酶（二级介质）（二级介质）脓毒综合征脓毒综合征（发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）（发热、低温、心动过速、尿少、酸中毒、低血压）DIC内毒素休克内毒素休克MOSF（多器官功能衰竭）（多器官功能衰竭）死　亡死　亡6内毒素的生物学效应内毒素的生物学效应l发热反应发热反应l白细胞反应白细胞反应l内毒素血症（内毒素血症（ETM）与内毒素休克（）与内毒素休克（ETS））l弥漫性血管内凝血（弥漫性血管内凝血（DIC）） 7二、内毒素的检测二、内毒素的检测目前内毒素检测的方法主要有：目前内毒素检测的方法主要有：Ø 鲎试验鲎试验Ø ELISA法法Ø 结合免疫鲎试验法（结合免疫鲎试验法（IML））Ø 自动化动力学方法自动化动力学方法Ø 化学发光法化学发光法Ø 光纤维生物传感法光纤维生物传感法Ø 毛细管电泳法毛细管电泳法8鲎试验鲎试验 鲎鲎试试验验（（LT））检检测测LPS机机理理是是LPS通通过过激激活活C、、B因因子子、、前前凝凝固固酶酶而而使使可可凝凝蛋蛋白白变变成成凝凝固固蛋蛋白白，，形形成成肉肉眼眼可可见见的的胶胶冻冻状状物物，，通通过过比比浊浊，，对对LPS进进行行半半定定量量或或定定量量检检测测。

该该法法简简单单、、无无需需特特殊殊设设备备、、耗耗费费少少、、敏敏感感性性较较好好，，可可检检测测出出0.01~1ng/ml的的LPS，，但但易易受受多种因素的影响多种因素的影响9 ①①标标本本颜颜色色的的深深浅浅可可使使敏敏感感性性偏偏低低；；②②受受血血浆浆中中LPS抑抑制制因因子子的的干干扰扰；；③③非非特特异异性性凝凝血血酶酶、、凝凝血血活活酶酶、、核核糖糖核核酸酸酶酶、、胰胰蛋蛋白白酶酶等等均均可可使使鲎鲎变变形形细细胞胞溶溶解解物物产产生生假假阳阳性性反反应应；；④④LT法法的的标标准准化化问问题题（（目目前前国际尚无统一标准）国际尚无统一标准）10 ELISA法法 利利用用多多粘粘菌菌素素B ﹑L－－聚聚组组氨氨酸酸及及广广谱谱交交叉叉反反应应性性的的抗抗LPS－－McAb与与LPS有有广广泛泛的的结结合合能能力力的的特特点点，，用用其其包包被被微微量量反反应应板板，，加加入入待待检检样样品品，，再再加加抗抗LPS单单克克隆隆抗抗体体（（McAb）），，通通过过酶酶标标二二抗抗的的显显示示来来定定量量测测定定LPS，，该该法法敏敏感感性性不不高高（（0.5ng/ml）），，与与LT法的相当法的相当,但定量准确性高于但定量准确性高于LT法。

法11结合免疫鲎试验法（结合免疫鲎试验法（Immunolimulus, IML）） 以以广广泛泛交交叉叉反反应应性性抗抗LPS－－McAb（（Wn1222-5））来来捕捕获获LPS，，再再与与鲎鲎试试剂剂反反应应，，可可定定量量检检测测样样本本中中肠肠杆杆菌菌科科细细菌菌感感染染所所释释放放的的LPS，，敏敏感感性性可可达达100pg/ml该该法法以以抗抗LPS单单克克隆隆抗抗体体为为探探针针使使内内毒毒素素血血症症检检测测特特异异性性得得以以改改善善，，且且不不受受标标本本浊浊度度、、放放置置时时间间、、抑抑制制因因子子等等非非特特异异性性因因素素的的影影响响，，但但仍仍不不能避免鲎试剂自身因素的影响能避免鲎试剂自身因素的影响12自动化动力学方法自动化动力学方法 该该方方法法先先用用KOH的的复复合合碱碱试试剂剂在在微微量量反反应应板板上上对对血血浆浆标标本本进进行行预预处处理理，，以以去去除除或或灭灭活活其其中中的的干干扰扰因因子子及及酶酶抑抑制制物物，，再再直直接接加加入入对对LPS高高度度特特异异的的产产色色鲎鲎试试剂剂（（Endospecy）），，随随后后启启动动动动态态显显色色测测定定程程序序，，检检测测仪仪自自动动绘绘制制30min内内的的各各孔孔反反应应曲曲线线，，根根据标准曲线计算出样本中的据标准曲线计算出样本中的LPS浓度。

浓度 13 该该方方法法对对LPS的的定定量量范范围围为为10~100pg/ml反反应应中中所所用用产产色色鲎鲎试试剂剂不不含含G因因子子，，因因此此可可避避免免与与标标本本中中存存在在的的真真菌菌发发生生凝凝固固作作用用而而出出现现非非特特异异性性反反应应，，其其优优点点还还体体现现在在标标本本先先用用碱碱处处理理，，从从而而克克服服了了鲎鲎试试剂剂内的一些影响因素内的一些影响因素14化学发光法化学发光法 利利用用CR1和和CR3受受体体诱诱导导中中性性多多核核粒粒细细胞胞中中的的氧氧化化产产物物作作为为检检测测平平台台，，依依靠靠LPS－－LPS抗抗体体复复合合物物使使全全血血中中的的中中性性粒粒细细胞胞所所释释放放的的氧氧化化物物质质，，引引起起补补体体调调理理酵酵母母多多糖糖，，导导致致发发光光物物质质（（CL））氧氧化化而而发发光光，，通通过过仪仪器器光光学学系系统统检检测测发发光光的的强强度度而而定定量量测测定定血血中中的的内内毒毒素素，，对对LPS定定量量范范围围为为20~200pg/ml该该法法对对大大多多数数革革兰兰氏氏阴阴性性杆杆菌菌的的LPS有有广广泛泛的的反反应应性性，，而而对对革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌、、曲曲霉霉菌菌等等无无反反应应，，可可望望成成为为临临床床诊断内毒素血症的有用工具。

诊断内毒素血症的有用工具15光纤维生物传感法光纤维生物传感法 利利用用短短波波光光纤纤维维生生物物传传感感器器检检测测LPS，，最最低低敏敏感感性性为为10ng/ml，，可可在在30s内内完完成成其其原原理理是是共共价价结结合合于于光光纤纤维维探探针针表表面面上上的的多多粘粘菌菌素素B可可选选择择性性地地结结合合荧荧光光标标记记的的LPS，，未未标标记记的的LPS在在竞竞争争试试验验中中根根据据已已标标记记的的LPS产产生生的的荧荧光光强强度度得得以以定定量量检检测测此此法法不不仅仅应应用用于于临临床床而而且且还还可可应应用用于于环环境境中中LPS的的检检测测，，该法虽快速简便，但敏感性不如该法虽快速简便，但敏感性不如IML法和法和ELISA法16毛细管电泳法毛细管电泳法 LPS是是缺缺乏乏有有旋旋光光力力的的基基团团，，检检测测其其未未衍衍化化的的状状态态比比较较困困难难硼硼酸酸盐盐可可与与LPS分分子子的的二二乙乙基基结结合合使使其其旋旋光光力力增增强强，，采采用用UV活活性性多多粘粘菌菌素素B与与LPS形形成成复复合合物物或或荧荧光光素素异异硫硫基基氟氟酸酸盐盐标标记记LPS亦亦可可达达到到目目的的。

方方法法是是将将处处理理过过的的标标本本吸吸入入毛毛细细管管，，用用标标准准磷磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液（（100mg/ml））做做电电泳泳，，6min内内即即可可完完成成检检测测此此法法敏敏感感性性为为35pg/ml，，但但电电泳泳的的条条件件不不易易掌掌握握，，且且易易受受某某些些技技术术因因素素或或固固有有误误差差的的影影响响，，目目前尚难以推广应用前尚难以推广应用17MB－－80内毒素测定系统内毒素测定系统内毒素葡聚糖 18l仪器概述仪器概述 MB－－80内内毒毒素素定定量量测测定定系系统统是是专专门门用用于于定定量量测测定定药药品品、、生生物物制制品品、、血血液液制制品品、、医医疗疗器器械械及及食食品品中中的的内内毒毒素素含含量量，，更更重重要要的的是是在在临临床床上上用用来来测测定定病病人人各各种种体体液液中中细细菌菌内内毒毒素素的的含含量量水水平平，，以以诊诊断断及及鉴鉴别别诊诊断断内内毒毒素素血血症症及及感感染染的的类类型型和和程程度度，，也也作为观察内毒素血症疗效的重要指标作为观察内毒素血症疗效的重要指标19l检测原理检测原理 主主要要原原理理与与鲎鲎试试验验的的反反应应原原理理相相同同：：利利用用革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌脂脂多多糖糖激激活活酶酶反反应应主主剂剂A中中的的相相应应因因子子后后形形成成凝凝固固蛋蛋白白，，根根据据其其引引起起的的浊浊度度变变化化对对革革兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量测定。

兰氏阴性菌脂多糖浓度进行定量测定20三、内毒素检测的临床意义三、内毒素检测的临床意义正常参考值：正常参考值：正常人血浆内毒素含量正常人血浆内毒素含量<10pg/ml革革兰兰阴阴性性菌菌败败血血症症的的诊诊断断:通通过过测测定定人人血血浆浆中中的的内内毒毒素素即即可可对对G－－菌菌所所引引起起的的临临床床菌菌血血症症及及败败血血症症进进行行确确诊诊，，而而且且对对病病原原菌菌的的分分辨辨及及各各种种感染症状治疗及预后判定都具有很大帮助感染症状治疗及预后判定都具有很大帮助21呼呼吸吸道道感感染染：：由由革革兰兰阴阴性性菌菌所所引引起起的的肺肺炎炎、、胸胸膜膜炎炎及及慢慢性性支支气气管管炎炎时时，，一一般般在在血血中中的的内内毒毒素素水水平平均均较高22肝脏感染肝脏感染l甲甲肝肝：：甲甲肝肝的的内内毒毒素素血血症症发发生生率率为为58％％，，平平均均内内毒毒素素浓浓度度为为54.7pg/ml在在发发病病的的前前3周周内内毒毒素素最最低低水水平平为为37.7pg/ml5周后开始恢复正常周后开始恢复正常l乙乙肝肝：：急急性性乙乙肝肝内内毒毒素素血血症症的的发发病病率率占占51.9%，，随随着着病病情情的的缓缓解解内内毒毒素素水水平平逐逐渐渐下下降降。

慢慢性性活活动动性性乙乙肝肝时时出出现现内内毒毒素素血血症症者者占占53.7%，，并并且且有有80％％的的患患者者持持续续存存在在内内毒毒素血症l丙丙肝肝：：慢慢性性活活动动性性丙丙肝肝的的内内毒毒素素血血症症发发病病率率最最高高（（>80%）），，而而且且血血清清丙丙氨氨酸酸转转氨氨酶酶水水平平与与内内毒毒素素血血症症发发生率及含量无明显关系生率及含量无明显关系23肝肝硬硬化化：：肝肝脏脏可可摄摄取取血血流流中中内内毒毒素素的的80~90%，，由由于于肝肝硬硬变变后后造造成成的的肝肝枯枯否否氏氏细细胞胞清清除除能能力力下下降降及及肝肝内内组组织织结结构构和和血血流流的的改改变变，，肝肝内内毒毒素素摄摄取取减减少少，，造造成成严重的内毒素血症严重的内毒素血症胆胆道道疾疾病病：：胆胆石石症症伴伴胆胆囊囊炎炎的的内内毒毒素素血血症症的的发发生生率率为为78％％；；化化脓脓性性胆胆管管炎炎为为20％％；；梗梗阻阻性性黄黄疸疸的的程程度度与与内内毒毒素素浓浓度度以以及及持持续续时时间间有有一一定定关关系系，，术术后后的的内内毒毒素素血血症症发发病病率率为为50％％~75%，，是是术术后后出出现现并并发发症症和和患者死亡的一个重要原因。

患者死亡的一个重要原因24急急性性胰胰腺腺炎炎：：急急性性胰胰腺腺炎炎并并发发内内毒毒素素血血症症较较常常见见，，约约占占66％％，，值值得得注注意意的的是是致致死死病病例例生生前前均均并并发发内内毒毒素素血血症症且且持持续续存存在在直直至至死死亡亡因因此此早早期期测测定定内内毒毒素素水水平平有有助助于于判判断断疾疾病病的的严严重程度，指导治疗，防止恶化重程度，指导治疗，防止恶化溃溃疡疡性性结结肠肠炎炎：：此此病病的的内内毒毒素素血血症症发发病病率率高高达达100％％，，也也有有个个别别报报道道的的阳阳性性率率仅仅为为25％％但但多多数数认认为为内内毒毒素素血血症症是是该该病的重要并发症病的重要并发症25细菌性感染的辅助诊断、治疗和预后判断细菌性感染的辅助诊断、治疗和预后判断l全全身身性性细细菌菌感感染染：：全全身身性性细细菌菌感感染染主主要要见见于于败败血血症症革革兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌性性败败血血症症常常并并发发内内毒毒素素血血症症这这种种败败血血症症较较常常见见的的致致病病菌菌为为沙沙门门氏氏菌菌属属、、脑脑膜膜炎炎双双球球菌菌属属及及拟拟杆杆菌菌属属这这些些致致病病菌菌多多通通过过泌泌尿尿道道、、肠肠道道、、胆胆道道及及呼呼吸吸道道而而引引起起感感染染，，也也可可通通过过外外伤伤、、外外科科手手术术、、导导管管检检查查或或留留置置，，以以及及器器械械操操作作等等途途径径而而进进入入血血液液，，并并大大量量繁繁殖殖引引起起败败血血症症，，从而造成内毒素血症。

从而造成内毒素血症26l局局部部性性细细菌菌感感染染：：局局部部性性细细菌菌感感染染造造成成内内毒毒素素血血症症的的有有肺肺炎炎、、胆胆囊囊炎炎、、烧烧伤伤合合并并感感染染、、穿穿孔孔性性腹腹膜膜炎炎、、化化脓脓性性胆胆管管炎炎、、肝肝脓脓肿肿、、肾肾盂盂炎炎、、卵卵巢巢囊囊肿肿扭扭转转伴伴尿尿路路感感染染、、肠肠结结核核及及肺肺结结核核伴伴绿绿脓脓杆杆菌菌感染、非特异性出血性小肠炎及肾周围炎等感染、非特异性出血性小肠炎及肾周围炎等l对对尿尿液液进进行行内内毒毒素素测测定定可可成成功功地地检检出出革革兰兰氏氏阴阴性性细细 菌菌 菌菌 尿尿 症症 和和 厌厌 氧氧 性性 性性 阴阴 性性 杆杆 菌菌 菌菌 尿尿 症症(LPS≥50pg/ml)27u原因不明的发热原因不明的发热l免免疫疫低低下下患患者者原原因因不不明明发发烧烧时时，，如如果果找找不不到到细细菌菌感感染染迹迹象象和和菌菌血血症症侯侯，，内内毒毒素素血血症症可可能能是是引引起起发发热因素之一热因素之一28u外源性输注的内毒素血症的诊断外源性输注的内毒素血症的诊断 因因治治疗疗目目的的输输入入了了污污染染有有内内毒毒素素的的液液体体、、药药物物或或血液等也可引起内毒素血症。

血液等也可引起内毒素血症2930。