猪流行性腹泻病毒.ppt

猪流行性腹泻病毒分 离的研究报告 汇报人：刘腾飞 科前质量管理部－病毒组 l猪流行性腹泻病毒猪流行性腹泻毒一般概况以及国内外研究进展猪流行性腹 泻病毒的分离分离猪流行性腹泻病毒的讨论一、猪流行腹泻病毒的一般概况及国内外研究进展一、猪流行腹泻病毒的一般概况及国内外研究进展1.猪流行性腹泻病毒一般概况猪流行性腹泻病毒一般概况 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV) ，属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus) 感染动物之后主要以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病 它是引起10日龄仔猪100％死亡的传染病毒之一，每年给我国养猪业造成20～30亿左右的经济损失2.猪流行性腹泻病毒的基因结构特征猪流行性腹泻病毒的基因结构特征 PEDV基因组是单股正链具有感染性的RNA，与其他冠状病毒相似，其基因组5′端有一个帽子结构(cap)，3′端有1个Poly(A)尾，基因组全长为28 033 nt 。

基因组序列包括6个ORF，从5′～3′端依次为编码复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab)、纤突蛋白(S)即糖激化纤突蛋白、ORF3蛋白、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)即糖激化囊膜和核衣壳蛋白(N)的基因 3. PEDV的编码蛋白及其功能的编码蛋白及其功能1）非结构蛋白及其功能：）非结构蛋白及其功能：a.复制酶多聚蛋白复制酶多聚蛋白1ab(pp1ab) 它是由基因1编码的一个多功能蛋白质，预测分子质量为753ku，有13个预测蛋白酶切割位点的非结构蛋白，经共转译处理后产生与病毒基因组复制相关的一系列蛋白质，主要功能包括负链RNA、前导RNA、sgmRNA和子代病毒RNA的转录作用以及对多聚蛋白切割产生具有功能产物的蛋白酶切割作用 另外，ORF1a编码蛋白还含有3个转膜域(TM)ORF1b主要编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，同时有3个蛋白结构域分别是锌指蛋白域(Z)也称金属结合域、螺旋酶域(Hel)和保守序列域(C) b. ORF3蛋白：蛋白：ORF3蛋白是编码分子质量为25.3 ku的非结构 蛋白，通过限制性片段长度多态性分析适应Vero细胞的弱 毒PEDV和野毒PEDV的ORF3，发现ORF3与病毒毒力有关 .（（2））PEDV结构蛋白及其功能结构蛋白及其功能a.S蛋白：蛋白：S蛋白是由1 383个氨基酸组成、分子质量为180 ku～220 ku、位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要生物学作用。

目前，PEDV S蛋白中和表位在以烟草花叶病毒为载体的无烟碱烟草植物中得到了成功表达，表达蛋白免疫接种后，对仔猪具有良好的保护作用，为PEDV转基因植物疫苗研究奠定了物质基础 b.N蛋白蛋白 ：N蛋白是由441个氨基酸组成、分子质量为55 ku～58 ku、磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳 ，N蛋白有3个相对保守的结构域，位于中间的是一个能与病毒RNA前导序列结合的RNA结合域 ，N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达猪在感染PEDV的早期，体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，又鉴于其冠状病毒N蛋白保守性强，所以利用N蛋白来建立PEDV分子生物学诊断技术具有很好的应用前景 C.M蛋白蛋白 ：：M蛋白是由226个氨基酸组成、分子质量为27 ku～32 ku的膜糖蛋白，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用在补体存在的条件下，抗M蛋白囊膜外抗原表位的单克隆抗体能中和病毒的感染性另外，M蛋白能介导机体产生α干扰素，所以M蛋白可以作为PEDV基因工程疫苗的候选抗原 d. E蛋白蛋白 ：： E蛋白是由76个氨基酸组成、预测分子质量为8.8 ku、位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，对病毒的组装和出芽是必要的。

目前，研究者将PEDV的E基因和M基因导入甲病毒载体(pSFV)，在BHK-21细胞中得到了成功的表达，为进一步探讨E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基础  N蛋白（Nucleoprotein)、M蛋白（Membrane protein)、SM蛋白（small membrane protein)和S蛋白（Spike protein)，位于SM基因与S基因之间的ORF，命名为ORF3，编码未知功能且具有多态性的产物4.PEDV的临床症状的临床症状•猪流行性腹泻的病原是一种冠状病毒，与传染性胃肠炎的病原相似病毒破坏小肠茸毛，减小营养吸收面积，还导致体液损失，造成脱水易感群遭病毒侵入2～3周内即可产生很强的免疫，病毒就会从猪群消失，尤其是较小的猪群（<300头母猪）仔猪也可通过初乳获得免疫易感群初次接触病原时会爆发急性腹泻，这种情况下母猪发病率可达100％，有的表现为轻微的腹泻，有的则呈现水样下痢 •流行性腹泻有两种临床表现类型，PED I型只影响生长猪，而PED II型则影响各年龄阶段的猪只，包括哺乳仔猪和成熟母猪本病潜伏期为2 d，腹泻症状持续7～14 d哺乳仔猪当中病情可能较轻微，也可能很严重，死亡率最高可达40％。

在规模较大的猪群，尤其是集约化猪场当中，母猪群第一波不会被全部感染，而会反复感染没有母源抗体保护的仔猪会出现散发的临床症状 •具体表现为：（1）母猪：腹泻，可能较轻微，泻出牛粪样稀粪，也可能呈水样下痢；（2）仔猪：腹泻、脱水死亡率可能会很高；（3）断奶猪与生长猪：急性水样下痢，无血液或粘液死亡率通常较低，但发病率可能很高病毒首次侵入猪场后，可在包括生长群和繁殖群在内的所有猪只当中迅速传播，造成腹泻、呕吐，5～10 d内发病率可达100％潜伏期为2～4 d，呕吐 ▪ 眼观变化仅限于小肠，小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短组织学变化，见空肠段上皮细胞的空泡形成和表皮脱落，肠绒毛显著萎缩绒毛长度与肠腺隐窝深度的比值有正常的7：1降到3：1上皮细胞脱落最早发生于腹泻后2小时•病理变化病理变化 猪流行性腹泻具有特征性的病理变化主要见于小肠整个小肠肠管扩张，内容物稀薄，呈黄色、泡沫状，肠壁弛缓，缺乏弹性，变薄有透明感，肠粘膜绒毛严重萎缩25%病例胃底粘膜潮红充血，并有粘液覆盖，50%病例见有小点状或斑状出血，胃内容物呈鲜黄色并混有大量乳白色凝乳块（或絮状小片），较大猪（14日龄以上的猪）约10%病例可见有溃疡灶，靠近幽门区可见有较大坏死区。

•剖检变化表现为尸体消瘦、皮肤暗灰色皮下干燥，脂肪蜂窝组织表现不佳肠管膨胀扩张，充满黄色液体，肠壁变薄，肠系膜充血，肠系膜淋巴结肿胀 •镜下可见小肠绒毛缩短，上皮细胞核浓缩，胞浆嗜酸性变化腹泻严重时，绒毛长度与隐窝比值由正常1：1可降为3：1剖检病变局限于胃肠道胃内充满内容物，外观呈特征性地弛缓小肠壁变薄、半透明显微病变从十二指肠至回肠未端，呈斑点状分布，受损区绒毛长度严重变短， 变短的绒毛呈融合状，带有发育不良的刷状缘小肠肠管扩张，呈黄色、泡沫状，变蒲有透明感等病猪肠道变蒲，呈黄色，有泡沫，空泡，透明小肠扩张，有稀粪，鼓起肠道鼓起，变透明肠系膜有充血，内充有黄色液体5.诊断技术病毒分离病毒中和试验免疫荧光RT-PCR竞争阻断ELISA上面三种方法虽然都能对PED作出准确的诊断，但是操作复杂而且耗时病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光RT-PCR竞争阻断ELISART-PCR竞争阻断ELISART-PCR病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验免疫荧光病毒分离病毒中和试验竞争阻断ELISA竞争阻断ELISART-PCR6.防治措施防治措施•因为是病毒病，所以本病没有特效疗法，抗生素对于本病的治疗几乎没有什么效果。

支持性治疗，如提供电解质溶液以及暖和的圈舍对于本病的治疗具有很大的帮助如果病毒初次侵入猪群，要保证所有成年动物早期全部受到感染，以便获得一致的免疫力可将患猪泻出的稀粪混在一桶水里喂给所有母猪，以便它们都能接触到病原 •生长猪染该病后不经治疗会自行康复，除非并发其它疾病，如：猪痢疾如果有其它疾病并发，可饮水或饲料添加抗生素，作预防性用药采用全进全出生产模式常会打断该病的循环，消灭该病用酚类、氯制剂和碘制剂等消毒剂可轻易将该病毒杀灭 •另外，猪病毒性腹泻的免疫防控要坚持三病(猪传染性胃肠炎TGE、猪流行性腹泻PED、猪轮状病毒RV)共防的原则,可用联苗进行免疫接种,也可使用单苗进行同步异途(以各个弱毒或灭活单苗所要求的接种方式多途径同时进行免疫接种) 免疫接种. 此三病都是通过粪/口途径传染,所以要加强环境卫生,及时清除粪便,加强哺乳期对母猪乳房、产床和产房以及保育舍地面的消毒,降低环境中的病原密度,减少传染机会. 免疫预防和环境消毒并重、药物治疗为辅,可最大限度地控制病毒性腹泻的发生.•目前疫苗免疫主要有下面几种疫苗：灭活苗：猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎二联油乳剂灭活疫苗 ；猪流行性腹泻灭活疫苗[甲醛氢氧化铝灭活疫苗（单苗）] 弱毒活疫苗：华毒株疫苗（猪传染性胃肠炎弱毒疫苗），哈尔滨兽医研究所研制生产的猪传染性胃肠炎-轮状病毒二联弱毒苗，以及日本研制的浮羽株弱毒活疫苗、h-5株弱毒活疫苗、163弱毒株疫苗，美国RV弱毒苗、RV-TGEV二联弱毒苗和前苏联的三联弱毒苗 。

•还在研制的疫苗有如下几种：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、广州动植物检疫局、江苏农科院畜牧兽医研究所和中国农业大学等单位正在研制TGE-PED二联弱毒苗 、福建省生物药品厂同中国农大联合开发的TGE-PED-RV三联弱毒苗不久将用于养猪生产 7.展望展望 PEDV是引起猪胃肠道疾病的重要病原之一，随着分子生学的不断发展，近年来对有关PEDV 分子生物学、诊断技术等方面的的研究取得了很大的进步，但是与其他冠状病毒成员相比，其研究还相对落后许多，尤其在PEDV的新型高效疫苗、反向遗传操作、黏膜免疫机理和病毒致弱机制等方面还有待深入的研究随着对PEDV研究越来越广泛和深入，PEDV的研究也将同其他冠状病毒一样将会更加深入 二、猪流行性腹泻病毒的分离二、猪流行性腹泻病毒的分离●1971年，在英国的猪群中首次发现猪流行性腹泻（PED），直到1978年，英国和比利时才证实，引起PED的病原体为冠状病毒PED和猪传染性胃肠炎TGE是由不同血清的冠状病毒引起危害以消化器官为主的两个类似的猪的传染病因此单靠临床症状和组织病理学检查来作出鉴别诊断是比较困难的，必须借助于血清学和病原学的检验。

但是，由于在细胞培养物中使用胎牛血清会起到抑制冠状病毒吸收进入细胞膜受体的作用，使PED病毒在细胞培养物中生长繁殖受阻，从而对PED病毒的应用研究带来了一定的困难•因此，从PEDV发现开始，很多研究人员尝试用不同的方法将PEDV适应于细胞，但用了近10年的时间都没有取得成功，这在一定程度上制约了PEDV研究进程直到1988年，Hofmann等首次在培养基含胰酶的Vero细胞上成功繁殖出PEDV，并认为胰酶对PEDV纤突糖蛋白切割作用增强了病毒对Vero细胞的感染力，此方法在PEDV分离、细胞培养和疫苗的研究中被广泛应用 •此后，Kusanagi K等研究者对PEDV细胞培养进行了深入研究，相继在仔猪膀胱、肾脏的原代细胞和KSEK6、IB-RS-2（猪肾细胞）、MA104（猴肾细胞）、CPK、ESK（猪肾细胞）的传代细胞系上成功培养了PEDVPEDV在细胞上的成功培养对其研究具有重要意义，解决了PEDV研究的瓶颈问题，为PEDV理化特性、疫苗及其相关分子生物学的研究奠定了物质基础，使PEDV的研究进入了一个新阶段 ●关于PEDV的细胞培养 有关PEDV在细胞上培养难的问题一直是制约对该病毒生物学特性研究的重要因素之一，也正因如此，许多国内外学者多年以来一直锲而不舍寻找解决该问题的办法。

 国外学者国外学者对此研究的成果此研究的成果•1988年，瑞典学者Hoffman采用胎猪原代细胞（肠、肺、肾、肝、脑和皮肤细胞）和对冠状病毒易感的稳定细胞系（Vero、PD5、PK15、HRT18细胞）做PEDV接种细胞实验结果表明了除了接种PEDV的Vero细胞产生病变以外，其他细胞均未检测到CPE产生，且维持液中未加胰酶的Vero细胞除了第一代检测到病毒的复制外，再往下传代就没有检测的病毒的复制由此Hoffman得出的结论是：PEDV必须在有胰酶为辅助的Vero细胞上进行体外繁殖•1999年，日本学者Masaaki Ono等人用Vero细胞、MA104细胞、未喂初乳的仔猪膀胱上皮细胞（SB1、SB2）、未喂初乳的仔猪肾细胞（SK）做PEDV接种细胞实验实验结果表明，PEDV可在维持液中加有胰酶的Vero、 SB1、 SB2、 SK细胞上产生病变，但出现在SB1、 SK细胞的CPE要晚于Vero细胞，病毒在SB2和MA104细胞传至第5代均检测到CPE此学者得出的结论是PEDV不仅可以在维持液中加有胰酶的Vero细胞上繁殖，也可以在维持液中加有胰酶的SB1、 SK细胞上繁殖此结论拓延了Hoffman只在Vero细胞上培养PEDV获得成功局限。

•2002年，韩国学者D.S.Song用Vero细胞分离出一株PEDV DR13毒株，通过加有胰酶维持液的Vero细胞连续传代来制弱DR13毒株，为PEDV疫苗的研制奠定基础国内学者国内学者对此研究的成果此研究的成果 关于关于PEDV细胞培养的研究，我国学者也一直致力于胞培养的研究，我国学者也一直致力于该方面方面的研究，多年来做的研究，多年来做过不少不少这方面方面报道：道：•1984年，宜化等人运用猪胎肠组织原代单层细胞培养物进行了猪流行性腹泻病毒吉毒株的培养与传代试验，试验结果发现，猪流行性腹泻病毒吉毒株（以及华毒株，川毒株）可以在猪胎肠组织原代单层细胞培养物上良好地增殖，其感染力高达105.5-8.0TCID50/0.05ml这也是我国关于PEDV原代细胞培养的最早报道•1991年，李树根等人在没有胰酶的条件下，通过PK15和Vero细胞培养分离繁殖PEDV，但是没有成功而在每毫升含60微克胰酶的Vero细胞维持液中，PEDV培养获得成功，从而他证明了所添加的胰酶对PEDV细胞培养物的重要性•1993年，李树根等人在含有胰酶的细胞维持液条件下，用Vero细胞培养传代PEDV 12代，转入不加胰酶条件下，再用Vero细胞传19代，出现病变，继后转用PK细胞传22代，适应PK15、Vero细胞生长直到53代，转用ST细胞培养，传4代，细胞出现CPE，由此可见，所分离的PEDV先后适应Vero细胞、PK细胞、ST细胞培养方法是成功的。

•1996年，童坤周等人通过Vero、PK、ST细胞株的连续传代，证明第72代PEDV毒已被制弱用83代毒（P83）做弱毒苗试验，试验证明P83制备的弱毒疫苗的总免疫效力达94.6﹪，表明P83病毒已具备弱毒疫苗株的要求从而说明PEDV弱毒的制弱可以通过细胞代次的方式• 2000年，唐永兰等人证明已适应于Vero细胞100代的PEDV病毒，能在ST细胞上繁殖•2003年，赖月辉等人在PK15传代细胞培养液中加入60ug/ml胰酶的方法成功分离到PEDV，并且证明PEDV一旦适应了PK15传代细胞，传至一定代次不加胰酶处理，也能在PK15传代细胞生长繁殖，且毒价不变•2007年，李宝贤报道先转染对PEDV非许可性的MDCK细胞，表达pAPN，从而使MDCK细胞对PEDV获得易感性总之，多年来许多国内外学者一直围绕PEDV细胞培养这个中心，展开对PEDV其它生物学特性的研究通过多年的努力，由PEDV适应细胞培养到PEDV感染细胞受体的研究，已取得不同程度的成果，这位大量繁殖PEDV，提高PEDV适应细胞的滴度以及其血清学、免疫学、病原生物学特性和其疫苗研制等提供了重要的物质基础●选择体外培养PEDV的细胞系就这个问题许多学者都选择了Vero细胞作为培养PEDV的理想细胞系，但是不同来源地Vero细胞对PEDV的敏感性不同，有的Vero细胞对病毒的易感染性极低（Hofinann和Wyler,1998），初次分离，很难成功。

要想使Vero细胞获得对PEDV易感染性，需要有胰蛋白酶的辅助，不同来源的Vero细胞对胰酶的耐受性不同•钱永清等报道，所用的Vero细胞可耐受60ug/ml的胰蛋白酶，且适应Vero细胞生长的病毒，亦可在PK15、IBRS-2以及ST细胞中在不加胰蛋白酶条件下均可生长•Hofinann,Ishikawa K,K weonCH等人分别报道浓度为5～10ug/ml胰蛋白酶是细胞所能耐受的浓度而且Hofinann和Wyler等通过实验表明不加胰酶培养PEDV是，病毒感染细胞的能力会大大减弱，如此连续培养几代后，会使病毒在细胞上发生丢失•许多学者也报道了，PEDV在细胞上产生的病变不明显，特别是在最初几代的培养更是如此日本和韩国报道（Ishikawa K等，Kweon CH等）病毒在Vero细胞上传90代以上病变特征仍不明显，必须借助于PCR检测方法才能确定病毒是否生长而1988年瑞典Hoffiman等首次在Vero传代细胞的培养液中加入胰酶，连续传5代就出现细胞病变由此看来，不同的研究者对PEDV在细胞上的病变特征、病变出现的时间、病毒培养的方法以及接种病毒的Vero细胞所用的胰酶浓度等试验结果有一定的差别，这等等一些差别需要我们病毒组以及质检室所有人积极主动出谋划策，参与进来为能分离出PEDV做出贡献。

●PEDV在Vero细胞上的病变特征不同时间段细胞会出现：⑴细胞肿胀变圆，折光性增强，颗粒物质增多，细胞大量脱落崩解，细胞间隙变大，细胞拉成网状⑵细胞产生大的空泡，细胞融合，表现为多核细胞等病变●PED病毒的分离的方法待检粪便样品研磨（PBS 1︰10，PH=7.4）匀浆冻融2-3次后，2000-12000rpm，4℃离心15-30min收集上清0.22um过滤，分装成小份-70 ℃ 保存加2％双抗）取1ml接于已经长满单层的Vero-E6细胞接种之前先倒掉细胞生长液，并用含5ug/ml胰酶的DMEM维持液洗两遍）吸附1小时，同时设细胞对照倒掉并内的病毒液，用DMEM维持液洗两遍（不含血清的DMEM)也可以根据情况不倒掉病毒液，或不洗细胞需要摸索）加入含5ug/ml胰酶浓度的DMEM维持液每天观察2-3次一般72小时收获病毒液RT-PCR适时监测病毒在细胞内增殖的情况继续用收获的病毒液传代（收获的病毒可以冻融之后接种）●结果•别人的结果：套式PCR监测•不同时间（12h、24h、48h）段细胞变化以上就是在Vero细胞上接种PEDV后于不同时间产生的病变•间接免疫荧光检测•自己分离PEDV的试验结果：⑴、由于种种原因，试验于5月底开始。

RT-PCR检测的结果 从左到右分别是：原代PEDV、TGEV、RV；目的条带663bp盲传盲传 Marker右边为第一代，左边为第二代•2012年7月6号-10号重新将剩余的病料处理好检测并接种 从左往右分别是：Marker、阴性对照、四个原代毒、两个第一代病毒液、第五代、第四代注明：这副图的第四代，第五代扩增的样品是第一次处理的病料，结果检测不到PEDV的存在了•2012年8月8号RT-PCR结果从左往右依次是：湖二代、湖三代；第Ⅳ代4℃、第Ⅳ代37 ℃、第Ⅴ代4 ℃、第Ⅴ代37 ℃;7.19第Ⅲ代；阴性对照；Marker 2000;•试验中传代细胞的变化于是就收获病毒液（冻融取样检测）三、讨论1、病料的处理：病料研磨之后成匀浆，需离心后再过滤除菌，但是离心的转速各有所不同，还有时间也不一样2、匀浆冻融的次数3、接毒的细胞量；接毒的病毒量；接毒之后感作的时间与温度，以及感作之前细胞的处理完了之后补充维持液的时候是否要把所接的病毒液倒掉，另外还要用维持液或PBS洗吗？4、DMEM维持液中胰酶的浓度，3、5、10、30、60ug/ml不等，因为有研究报道浓度不一样出现CPE的情况也有所不同。

还有维持液中是否需要加血清5、培养细胞所用的培养基与无血清DMEM维持液是否一致因为细胞用的生长液大都不一致各有所不同，也许是根据细胞的特性来选择另外维持液中是否需要加入血清，有的研究人员加，有的又不加6、细胞传代：常规法，带毒传代法7、信心和时间以及大家的支持与帮助谢谢大家！谢谢大家！  各位辛苦啦，谢谢！汇报结束，请各位批评指正！汇报结束，请各位批评指正！。