三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨.doc
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1三氯化铝比色法测定中药总黄酮方法的探讨作者：马陶陶 张群林 李俊 孟晓明 黄成 陈玉璞【摘要 】 目的探讨以芦丁作为对照品，采用三氯化铝（ＡｌＣｌ３ ）比色法测定中药总黄酮含量的专属性，并建立ＡｌＣｌ３比色法测定中药总黄酮含量的最优条件方法通过对几类典型结构的黄酮类及多酚类化合物ＡｌＣｌ３显色前后的吸收峰（２００ ～６００ ｎｍ）进行比较，分析以芦丁为对照品的ＡｌＣｌ３ 比色法测定中药总黄酮的合理性结果ＡｌＣｌ３ 显色后，部分黄酮类物质在４２１ ｎｍ 处有较强吸收结论采用ＡｌＣｌ３ 比色法测定中药总黄酮的含量具有合理性，并建立了ＡｌＣｌ３ 比色法测定中药总黄酮含量的最优条件 【关键词】 ＡｌＣｌ３ 比色法 总黄酮 芦丁Abstract：ObjectiveＴｏ ｄｉｓｃｕｓｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｏｆ ＡｌＣｌ３ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｒｕｔｉｎ ａｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ on ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ 2ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡｌＣｌ３ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．MethodsTo mａｋｅ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｉｃａｌ structure ｗｉｔｈ ＡｌＣｌ３ ａｎｄ measure ｔｈｅｉｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ２００ ～６００ ｎｍ．ResultsＡｔ ｔｈｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ４２１ ｎｍ，ｓｏｍｅ flavonoid-like compounds showed ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｕｔｉｎ ．Conclusion Ｉｔ ｉｓ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ the ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＡｌＣｌ３ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ ｒｕｔｉｎ ａｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＡｌＣｌ３ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．Key words：ＡｌＣ３ cｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ； Ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； Ｒｕｔｉｎ黄酮类化合物（Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）是以Ｃ６ －Ｃ３ －Ｃ６ 结构为基本母核的色原烷或色原酮的衍生物，以其广泛的药3理作用倍受青睐，而中药材中总黄酮的含量测定成为近年来研究黄酮化合物所关注的焦点。
中药总黄酮的含量测定一般采用比色法、高效液相色谱法等［１］ 比色法是被《中国药典》所采用的最常见的总黄酮测定方法，其中又以ＮａＮＯ２ －Ａｌ（ＮＯ３ ）３ －ＮａＯＨ 比色法常用［２］ 这种方法以ＮａＮＯ２ －Ａｌ（ＮＯ３ ）３ 为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮物质生成红色铝螯合物为特征，以芦丁为对照，在５１０ ｎｍ 处测定吸光度，从而得到待测物质总黄酮的含量郭亚建等［３］ 曾对这种方法的专属性进行了讨论，发现具有邻二酚羟基的非黄酮类物质在芦丁显色的最大波长处（５１０ ｎｍ 左右）也有较强吸收，而黄酮类成分黄芩素、山柰酚在此波长处没有吸收，从而说明采用ＮａＮＯ２ －Ａｌ（ＮＯ３ ）３ －ＮａＯＨ 比色法，以芦丁作为对照，不能排除非黄酮类物质的干扰，这种方法测定中药总黄酮含量的专属性不强因此，本实验采用另一种常用的比色法：ＡｌＣｌ３ 比色法，对几类典型结构的黄酮类化合物（芦丁、儿茶素、木犀草素、鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、葛根素、金丝桃苷、橙皮苷）及多酚类化合物（２，３ －二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸）ＡｌＣｌ３ 显色前后的吸收峰（２００ ～６００ ｎｍ）进行比较，分析以芦丁为对照品的ＡｌＣｌ３ 比色法测定中药总黄酮的合理性，并对芦丁显色的ｐＨ 值，ＡｌＣｌ３ 浓度、显色温度等条件进行4优化研究。
1 仪器与试药Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３ 紫外分光光度计；ＰＨＳ －３Ｃ 精密ｐＨ 计（上海雷磁仪器厂） 试剂：芦丁，葛根素，２，３ －二羟基苯甲酸，绿原酸，和厚朴酚，阿魏酸，儿茶素，木犀草素，异鼠李素，山柰奈酚，槲皮素，金丝桃苷，蒙花苷、橙皮苷均购自中国药品生物制品检定所三氯化铝，醋酸钠，冰醋酸，甲醇均为分析纯，水为双蒸水2 方法2.1 供试品的制备以芦丁为例，精密称取芦丁标准品（１２０ ℃ 烘干至恒重）１０．０ ｍｇ，甲醇定容至５０ ｍｌ，配成０．２ ｍｇ／ｍｌ 的芦丁母液2.2 显色试剂的配置精密称取ＡｌＣｌ３１．３４ ｇ，甲醇定容至１００ｍｌ，配成０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的溶液精密称取ＣＨ３ ＣＯＯＮａ·３Ｈ２Ｏ ２．７２ ｇ，双蒸水溶解至１００ ｍｌ，配成０．２ ｍｏｌ／Ｌ 的溶液精密量取１．１５ ｍｌ 5冰醋酸， 双蒸水稀释至１００ ｍｌ 配成０．２ ｍｏｌ／Ｌ 的醋酸溶液［４，５］ 2.3 芦丁紫外吸收峰的扫描精密量取１ ｍｌ 芦丁母液溶液，置于１０ ｍｌ 容量瓶，加入２ ｍｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的ＡｌＣｌ３ 溶液，甲醇定容，充分显色２０ ｍｉｎ［６］ ，在２００ ～６００ ｎｍ 范围扫描，记录吸光度值。
2.4 供试品紫外吸收峰的扫描精密量取１ ｍｌ 供试品（芦丁，葛根素，２，３ －二羟基苯甲酸、绿原酸、阿魏酸、和厚朴酚、儿茶素、木犀草素、异鼠李素、山柰奈酚、槲皮素、金丝桃苷、蒙花苷、橙皮苷） ，按“２．３” 项下方法，在２００ ～６００ ｎｍ 扫描样品的紫外吸收峰2.5 标准曲线及可行性考察从芦丁母液中精密移取０．０，０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ ｍｌ 溶液，平行两份，第１ 份直接加入２ ｍｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的ＡｌＣｌ３ 显色２０ ｍｉｎ；第２ 份加入２ ｍｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３ ， １ｍｌ ｐＨ 为５．２ 的ＮａＡＣ －ＨＡＣ 缓冲溶液，４０℃水浴显色１０ ｍｉｎ，分别做标准曲线，并以金丝桃苷为样品，考察方法的可行性63 结果3.1 芦丁显色的紫外光谱图在黄酮类化合物的紫外光谱图上，主要有苯甲酰基部分引起的吸收带Ｉ （３００ ～４００ ｎｍ）和桂皮酰基部分引起的吸收带ＩＩ （２４０ ～２８０ ｎｍ） ，加人铝盐可使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的络合物，带Ｉ 红移，吸光度明显增大当加入ＡｌＣｌ３ 充分显色后，芦丁吸收峰从３５９ ｎｍ 红移至４２１ ｎｍ，且吸光度有所增加。
见图１图１ 芦丁加入ＡｌＣｌ３ 前后的紫外光谱图（略）3.2 ＡｌＣｌ３ 比色法专属性探讨在２００ ～６００ ｎｍ 对几种典型结构的黄酮类物质及多酚类物质ＡｌＣｌ３ 显色前后的紫外吸收峰进行比较，结果发现显色后金丝桃苷、异鼠李素、山柰奈酚的吸收峰位置和芦丁的相似，都在４２１ ｎｍ 左右，而其他物质的与芦丁的不同如图２ 为显色后各物质的紫外光谱图图２ １４ 种物质显色后的紫外光谱图（略）3.3 显色条件的优化3.3.1 ｐＨ 值的影响采用ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲盐溶液调节溶液的ｐＨ 值，实验表明，当缓冲盐的ｐＨ 值小于５．２ 时，7芦丁的吸收峰在４０２ ｎｍ 左右，且吸光度值较小；当ｐＨ 值在５．２ ～６．０ 时，吸收峰在４２１ ｎｍ 左右，吸光度值增大，如图３（ａ） 且当ｐＨ 值为５．２时，吸光度值最大，因此选择ｐＨ 为５．２ 的ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲盐体系作为优化的显色条件之一3.3.2 ＡｌＣｌ３ 的浓度以２ ×１０－５ ｇ／ｍｌ 的芦丁溶液，ｐＨ 值５．２的ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲盐为条件，在６．６ ×１０－５ ～０．３３ ｍｏｌ／Ｌ 范围内讨论ＡｌＣｌ３ 浓度对芦丁吸收峰的位置及吸光度大小的影响，结果发现： １∶６００≤n 芦丁：ｎＡｌＣｌ３≤ １∶２ 时，即ＡｌＣｌ３ 浓度为３．３ ×１０－４～０．１ ｍｏｌ／Ｌ 时，吸收峰在４２１ ｎｍ 左右，且吸光度的值随ＡｌＣｌ３ 浓度的增加而变大。
如图３（ｂ）所示n 芦丁：ｎＡｌＣｌ３ ＞１：２，即ＡｌＣｌ３浓度小于３．３ ×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ 时，吸收峰在３６５ ｎｍ 左右，且吸光度减小n 芦丁：ｎＡｌＣｌ３＜１：６００，即ＡｌＣｌ３ 浓度大于０．１ ｍｏｌ／Ｌ，吸收峰移至４０４ ｎｍ 左右，且吸光度减小因此选择ＡｌＣｌ３ 浓度为０．１ ｍｏｌ／Ｌ 为芦丁显色的优化条件之一83.3.3 显色温度对吸光度的影响实验中由于显色时间较长，为了提高效率，采用水浴加热加热１０ ｍｉｎ，考察水浴温度对吸收峰位置及吸光度大小的影响如图３（ｃ） 结果表明，水浴温度４０℃是芦丁显色的优化条件之一图３ 显色条件对芦丁吸光度的影响（略）3.4 显色稳定性考察以２ ×１０－５ ｇ／ｍｌ 芦丁溶液，０．１ ｍｏｌ／ＬＡｌＣｌ３ ，ｐＨ 值５．２ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲溶液为条件，考察显色的稳定性，结果表明，显色１５０ ｍｉｎ，吸光度变化的 RSD 为２．８６２％，说明以芦丁为对照，ＡｌＣｌ３比色法显色稳定3.5 线性及可行性考察以一定浓度的金丝桃苷作为样品，直接加入２ ｍｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ 的ＡｌＣｌ３ ，显色２０ ｍｉｎ，其标准方程：Y＝０．００７ ７９＋２７ ３５１．１９０ ４８X，RＡ ＝０．９９９ ２２，测得的金丝桃苷的浓度是２．７５ ×１０－４ ｇ／ｍｌ，回收率为１２１．１５％；而优化后的方法：２ ｍｌ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３ ， １ ｍｌ ｐＨ 为５．２ 的ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲溶液，４０℃水浴显色１０ ｍｉｎ， 其线性方程为 Y＝０．００１ ５３ ＋２９ ５９５．２０９ ３２X，RＢ ＝０．９９９ ７２，测得的金丝桃9苷浓度为２．３０６×１０－４ ｇ／ｍｌ，回收率为１０１．５８％。
由此说明０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＡｌＣｌ３， ｐＨ５．２的ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲盐溶液，４０℃水浴显色１０ ｍｉｎ，方法的准确度更高，为ＡｌＣｌ３ 比色法的优化方法4 讨论葛根素、蒙花苷、橙皮苷加入ＡｌＣｌ３ ，反应前后紫外吸收峰的位置没有发生改变，而其余物质的紫外吸收峰均发生红移从结构上分析，葛根素、蒙花苷、橙皮苷只存在５ 位羟基，不存在邻二酚羟基和３ 位羟基，由此可见ＡｌＣｌ３ 的显色反应主要发生在３ 位羟基、４ 位羰基和邻二酚羟基，只存在５ 位羟基、４ 位羰基时黄酮类物质与ＡｌＣｌ３ 不发生反应芦丁与ＡｌＣｌ３ 发生显色反应，生成黄色络合物，在４２１ ｎｍ 左右有较强吸收实验对几种常见的多酚类化合物紫外光谱图进行了扫描，结果表明对于含邻二酚羟基的非黄酮化合物：２，３ －二羟基苯甲酸、阿魏酸、和厚朴酚、绿原酸，ＡｌＣｌ３ 显色前后在４２１ｎｍ 左右均没有吸收峰，消除了非黄酮类化合物对显色的干扰10槲皮素为芦丁的苷元，显色后在４３７ ｎｍ 左右有较大吸收，而芦丁的最大吸收峰在４２１ ｎｍ，说明黄酮的苷和苷元的极性相差较大，槲皮素３ 位羟基可能对反应有影响木犀草素的结构和芦丁相比，３ 位没有羟基，显色后在４１４ ｎｍ 有最大吸收，从而进一步说明３ 位羟基可能对ＡｌＣｌ３ 显色反应有影响。
具有典型结构的常见的黄酮类苷和苷元：金丝桃苷，芦丁，异鼠李素，山柰奈酚，ＡｌＣｌ３ 显色前在４２１ ｎｍ 处无吸收，显色后均在芦丁的最大吸收峰４２１ ｎｍ 左右有较大的吸收在现今的实验条件下，对于大多数黄酮类中药材而言，多含有黄酮苷，常见的苷在此波长处有较强吸收，而非黄酮类物质在此处无吸收因此以芦丁作为对照，ＡｌＣｌ３比色法可以成为测定中药总黄酮含量的理想方法对于任一络合反应，溶液的酸碱度会影响金属离子的水解及存在形式，影响络合物的组成当采用盐酸（氢氧化钠）调节显色溶液ｐＨ 值时，因其酸（碱）性较强，破坏络合物的结构，无法测得中药总黄酮含量的真实值，而采用ＮａＡｃ －ＨＡｃ 缓冲盐溶液时，加入前后芦。
