生物样品分析前处理技术 (2).doc

生物样品分析前处理技术生物样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题1.样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型例如，血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定2.根据被测定药物的结构、理化及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法例如，药物的酸碱性（pka）、溶解性质涉及到药物的提取手段；是否具有挥发性涉及到能否采用气相色谱法测定；药物的光谱特性及官能团性质涉及到分析仪器的选择、能否制成衍生物及应用特殊检测器的可能性药物在样品中的浓度相差很大，浓度大的样品，对前处理要求可稍低；浓度越低则样品前处理要求越高此外，药物在体内常产生许多代谢产物，其中一些代谢物仍具有药理活性，需要与原型药分别测定，因而也要了解药物的药理学性质和药物动力学特性3.样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同即纯化程度与所用测定方法的专属性、分离能力、检测系统对不纯样品污染的耐受程度等密切相关。

一般说来，放射免疫测定法由于具有较高的灵敏度和选择性，因此当初步除去主要干扰物质之后即可直接测定微量样品；而对灵敏度和专属性较差的紫外分光光度法，分离要求就要相应高一些；至于常用的高效液相色谱法，为防止蛋白质等杂质沉积在色谱柱上，上柱前需对生物样品进行去蛋白，有时对被测组分进行提取、制备衍生物等前处理样品处理步骤与分析方法的选择(一）去除蛋白质 在测定血样时，首先应去除蛋白质去除蛋白质可使结合型的药物均出来，以便测定药物的总浓度；去除蛋白质也可预防提取过程中蛋白质发泡，减少乳化的形成，以及可以保护仪器性能（如保护HPLC柱不被沾污），延长使用期限去除蛋白法有以下几种1.加入与水相混溶的有机溶剂 加入水溶性的有机溶剂；可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来常用的水溶性有机溶剂有：乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等含药物的血浆或血清与水溶性有机溶剂的体积比为1：（1～3）时，就可以将90％以上的蛋白质除去水溶性有机溶剂的种类不同时，析出的蛋白质形状亦不同；并且所得上清液的pH值也稍有差别，如用乙腈或甲醇时，上清液pH为8.5～9.5，用乙醇或丙酮时，上清液pH为9～10。

操作时，将水溶性有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后离心分离，取上清液作为样品通常分离血浆或血清用的离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全，而采用超速离心机（10000r／min）离心1～2min便可将析出的蛋白质完全沉淀离心时应用超速离心机专用的具塞塑料尖底管，可使析出的蛋白质牢固地粘在管底，便于上清液的吸取 2.加入中性盐 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等操作时，如按血清与饱和硫酸铵的比例为1：2，混合，离心（10000r/min）1～2min，即可除去90％以上的蛋白质所得上清液的pH为7.0～7.7这种利用盐析的方法与有机溶剂提取法并用时，药物的回收率高，因而常常被采用 3.加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀常用的强酸有：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5％偏磷酸等含药物血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心〈10000r／min）1～2min，就可以除去90％以上的蛋白质。

取上清液作为样品因加入了强酸，上清液呈酸性（pH0～4），在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白过量的三氯醋酸可经煮沸，分解为氯仿和二氧化碳而被除去；也有用乙醚提取过量三氯醋酸的方法过量的高氯酸可用碳酸钾、醋酸钾、氢氧化钠等中和，然后加乙醇使产生的高氯酸钾（钠）沉淀而被除去偏磷酸及硫酸-钨酸可用同法除去 4.加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀常用的沉淀剂有CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等离心分离后所得的上清液pH分别为5.7～7.3和6.5～7.5 5.酶解法 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素它不仅可使组织酶，并可使药物析出枯草菌溶素是一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈（PH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大活力酶解法操作简便先将待测组织加Tris-缓冲液（pH 105）及酶，60℃培育1h，用玻璃棉过滤，得澄清滤液，即可供药物提取用酶解法的优点是：可避兔某些药物在酸及高温下降解：对与蛋白质结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显着改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成，当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。

酶解法的主要问题是不适用于在碱性下易水解的药物二）缀合物的水解 尿中药物多数呈缀合状态一些含羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性物质葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸甙缀合物；还有一些含酚羟基、芳胺及醇类药物与内源性物质硫酸形成硫酸酯缀合物由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法 酸水解时，可加入适量的盐酸液至于酸的用量和浓度、反应时间及温度等条件，随药物的不同而异，这些条件应通过实验来确定对于遇酸及受热不稳定的药物，可以用酶水解法常用葡萄糖醛酸甙酶或硫酸酯酶或葡萄糖醛酸甙硫酸酯酶的混合酶酶水解很少使被测药物或共存物发生降解虽然酶水解的时间较常，以及由酶制剂带入的粘液蛋白可能导致乳化及色谱柱顶部阻塞的缺点，但仍被优先选用 （三）分离、纯化与浓集 不管分析目的是什么，其选择性是相当重要的这是因为内源性物质、代谢物或其它药物的干扰能影响分析结果 对于大多数药物而言，生物样品的分析通常由两步组成：样品的前处理（分离、纯化、浓集）和对最终提取物的仪器分析。

前处理是为了除去介质中含有的大量内源性物质等杂质，提取出低浓度的被测药物，同时浓集药物或代谢物的浓度，使其在所用分析技术的检测范围之内；分析的专属性也有部分取决于仪器分析这一步骤，但主要仍是样品的前处理 提取法是应用最多的分离、纯化方法提取的目的是为了从大量共存物中分离出所需要的微量组分----药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集提取法包括液-液提取法和液-固提取法1.液-液提取法（liquid-liquid extraction，LLE） 多数药物是亲脂性的，在适当的溶剂中的溶解度大于水相中的溶解度，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质因而用有机溶剂提取一次即可除去大部分杂质，从大量的样品中提取药物经浓集后作为分析用样品 应用本法时要考虑所选有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积及水相的pH值等 对所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大：沸点低，易于浓集、挥散；与水不相混溶以及无毒、化学稳定、不易乳化等最常用的溶剂是乙醚和氯仿等提取时所用的有机溶剂要适量一般有机相与水相（体液样品）容积比为1：1或2：1根据被测药物的性质及方法需要，可从实验中考察其用量与测定响应之间的关系，来确定有机溶剂的最佳用量。

PH的影响在溶剂提取中十分重要水相的pH随药物的理化性质的不同而异，但生物样品一般多在碱性下提取这是因为多数药物是亲脂性的碱性物质，而生物样品中的内源性物质多是酸性的，一般不含脂溶性碱性物质，所以在碱性下用有机溶剂提取时内源性杂质不会被提取出来曾有人将空白血清分别与pH2、pH7、及PH13的缓冲液混后用乙醚提取，提取液用RP-HPLC（UV-220nm检测）测定色谱图时（图），发现在碱性（pH13）下提取液的杂质峰最少，而在中性及酸性下杂质峰显着多而强 当一些碱性药物在碱性pH不稳定时，则在近中性pH处用氯仿和异丙醇提取而中性药物则在pH7附近提取（愚然它可在任一pH被提取）提取时于水相（体液样品）中加入有机溶剂后，一般只提取一次个别情况下（如杂质不易除去），则须将第二次提取分离出的含药有机相，再用一定pH的水溶液反提取（back extraction），然后再从水相将药物提取到有机相 液-液提取法的优点在于它的选择性，这是依赖于有机溶剂的选择；药物能与多数内源性物质分离；而且在使用非专属性的光谱法分析时，这是一个很大的优点例如，如果一个亲脂性药物的代谢程度很大，它的代谢物与母体化合物具有同样的发色团，这些代谢物将极大地干扰测试。

但如果采用一亲脂性溶剂进行提取，该药物能被选择性地提取，而将相对极性大的代谢物留在生物体液中如果是色谱法，则可利用亲水性溶剂提取药物和代谢物，从而达到分离并共同测定的目的但是，液-液提取法并不是适用于所有化合物例如，极性大的药物通常不能用该法提取，但使用离子对试剂，（ion pair reagent）的离子对提取法（impair extraction method），能够将液-液提取法的应用扩展到这类药物中 液-液提取法的缺点在于乳化现象的产生乳化作用能引起药物的损失，从而导致较低的回收率通常采用较大体积的提取用溶剂或温和的混合方法能克服乳化现象如果采用相对于样品体积较大体积的溶剂进行提取，在后续步骤中，需将被测组分浓集 ２.液-固提取法（liquid-solid extration，LES） 液－固提取法是近十几年来在纯化生物样品时被广泛采用的方法也可以认为是规模缩小的柱色谱法这种方法是应用液相色谱法原理处理样品将具有吸附、分配及离子交换性质的、表面积大的担体作为萃取剂填入小柱，以溶剂淋洗后，将生物样品通过，使其药物或杂质保留在担体上，用适当溶剂洗去杂质，再用适当溶剂将药物洗脱下来。

与LLE相比较，LES具有如下优点：LES较少引入杂质；消除了LIE的主要缺陷――乳化现象；提取效率高；可用少量生物样品进行分析（如50~100ul的血浆样品）；柱为可弃型，废弃物易从实验室移走；再最后洗脱中多采用以水为主的溶剂系统，大大增加了安全型；最大的优点为处理样品速度快、并在室温下操作，尤其适用于处理挥发性及对热不稳定药物 常用于填充柱的担体大致分为两类：第一类为亲水性的硅藻土等，它可以捕集全部样品，即样品全部吸附在担体颗粒表面，形成一薄层，然后采用一种与水不相混溶的有机溶剂倾入柱中，即可分离药物第二类常用疏水性的活性炭、聚苯乙烯或Ｃ18化学键硅胶等，它们可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂分离药物如填充离子交换树脂，可用于高极性、能电离药物的分离 在过去的十多年中，HPLC法色谱柱填充物的种类与数目迅速扩大，这给生物样品的液－固提取前处理法的发展带来了契机，各生产厂家制备出各种微型柱已在广泛地用作固体提取剂其中有的供手工操作，也有供自动化设备的 （１）液－固提取法的手工操作法：从市场上可得到含不同吸附剂的微型柱如由美国Analytichem International公司生产的 Bond Elut和由美国 Waters公司生产的 Sep-pak微型柱等，目前应用最广泛。

将样品溶解在适当的溶剂中，加到微型柱上端，在下端通过负压使溶剂流动，商品生产者已生产出“真空集合管”“自动离心式样品萃取器”等，能同时分析操作8～10个微型柱也可以通过在微型柱的上端利用注射器达到正压或用离心。