实验一_叶绿素的提取、理化性质和含量测定.docx

一、实验原理 叶绿素是植物光合作用色素，主要有 chla chlb ， 不溶于水 ,可溶于酒精.丙酮和石油醚叶绿素是叶绿酸的酯， 叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应叶绿素 分子含有一个卟啉 环的“头部”和一个叶绿醇 （ 植醇， phytol） 的“尾巴”卟啉环中的镁原子可被 H＋、 Cu2＋、 Zn2 ＋所置换 用酸处理叶片， H ＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色去镁叶绿素易再与铜离子结 合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象原因是当叶绿素分子吸 收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态-基态（ground state）上升到不稳定的高能状态-激发态（excited state ）叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光寿命很短处于第一三线态的 叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光二、 实验目的1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法 2．观察叶绿体中的各种色素 3．掌握叶绿素的物理和化学性质三、 实验用品1. 材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜 结晶、KOH-甲醇溶液等。

2仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、 研钵、试管、具塞锥形瓶等等四、 方法和步骤1、 叶绿体色素的提取• 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取 10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或 碳酸钙和10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素・在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙 酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液・沿分液漏斗的壁小心加入30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后， 弃去下面的丙酮一水层再加入30mL蒸馏水，轻轻晃动分液漏斗，以洗去石油醚中残留的丙酮，弃去水层 共洗两次将色素的石油醚提取液放入具塞锥形瓶中，置暗处或用黑纸包好备用2、 叶绿体色素的观察 取一张色层分析纸或定性滤纸代用，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用 滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢 地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环，由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b 为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。

3、 叶绿素含量的测定取1 ml叶绿素提取原液移入至10 ml容量瓶，石油醚定容（稀释液），以石油醚作为空白对照，测OD652・ 叶绿素浓度:C = OD652 / 34.5 （ mg/ml ）・ 叶绿素的含量（mg/g）=［叶绿素的浓度x提取液体积x稀释倍数］/样品鲜重4、 叶绿素理化性质的观察・光对叶绿素的破坏作用，在2支具塞试管中各放入2mL上述色素石油醚提取液，盖好塞子一支试管置暗处， 一支试管置强光（如太阳光）下，经2—3h后，取出2支试管观察溶液颜色有无变化，或在分光光度计上测定663nm 处吸光度值后进行比较・叶绿素的荧光，取2mL上述色素的石油醚提取液放入一支小试管中，可在窗口与入射光相垂直的方向观察叶 绿素暗红色的荧光・叶绿素的皂化反应，取1-2mL上述色素的石油醚提取液一试管中，逐步加入2-5mL新配制的30% 3KOH-甲醇 溶液，用力振动试管后静止分层，观察上下层溶液的变化65°C水浴5 min;取出冷却后，先加3 ml苯，后加3 ml 水（沿壁慢慢加入），轻轻摇匀，静置观察其分层现象・去镁叶绿素的形成，取1-2mL上述石油醚提取液放入试管中，小心加入3mL 6mol/L HCL，摇动后静止分层 观察溶液颜色变化。

・铜的取代作用，取1-2mL色素的丙酮提取液于试管中，加入3mL6mol/L HCL，摇动试管，再逐步加入醋酸 铜结晶（把试管放进65C水浴中微微加热），可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色，说明铜取代了氢占据 在镁在叶绿素中的位置五、 思考及讨论题叶绿素的皂化反应的原理？1 ． 铜的取代作用可观察到溶液的颜色由褐色变成鲜亮绿色的原因？。