酶的提取与分离纯化课件.ppt

Ⅳ￿Ⅳ￿酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化重点重点Ⅳ酶的提取与分离纯化一一 酶的下游加工流程酶的下游加工流程1.1.预处理预处理2.2.细胞过滤分离细胞过滤分离3.3.酶提取酶提取4.4.酶分离纯化酶分离纯化5.5.酶浓缩、结晶、干燥酶浓缩、结晶、干燥6.6.酶保存酶保存7.7.酶制剂成型酶制剂成型※※酶工程下游技术操作条件酶工程下游技术操作条件Ⅳ酶的提取与分离纯化二二￿ ￿预处理预处理1.1.加热：加热：使温度达到最适温度使温度达到最适温度2.2.凝聚，絮凝凝聚，絮凝3.3.加酸碱：加酸碱：达到最适达到最适PHPHⅣ酶的提取与分离纯化三三 细胞过滤分离细胞过滤分离1.1.细胞破碎法细胞破碎法⑴⑴机械破碎法：机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆研磨、搅拌、匀浆⑵⑵物理破碎法：物理破碎法：温度差法、压力差法、超声温度差法、压力差法、超声 波波空穴效应空穴效应⑶⑶化学破碎法：化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜⑷⑷酶破碎法：酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培 养，使溶酶体破裂自溶养，使溶酶体破裂自溶2.2.过滤方法：过滤方法：加压、常压、减压过滤法加压、常压、减压过滤法※※空穴效应：空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡，超声波使发酵液中产生许多小气泡， 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎气泡破裂产生内爆力使细胞破碎Ⅳ酶的提取与分离纯化四四 酶提取酶提取1.1.本质：本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出 细胞细胞2.2.方法：方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，盐溶法，有机溶剂溶解法，PHPH远离远离 PIPI3.3.条件：条件：T T：：0 0o oC-10C-10o oC C PH PH：：酶活力范围内，远离酶活力范围内，远离PIPI 提取液体积：提取液体积：酶液体积的酶液体积的2-52-5倍倍Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※酶工程下游技术操作条件酶工程下游技术操作条件T T：：0-100-10o oC C低温低温PHPH：：根据要求根据要求, ,远离或趋近远离或趋近PIPI加酶活保护剂：加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时有机溶剂提取、沉淀分离时防酶失活防酶失活Ⅳ酶的提取与分离纯化五五 酶的分离纯化酶的分离纯化沉淀分离沉淀分离膜分离膜分离离心分离离心分离层析分离层析分离电泳分离电泳分离等电点分离等电点分离Ⅳ酶的提取与分离纯化㈠㈠沉淀分离沉淀分离一一￿盐析法盐析法1.1.原理原理: :高浓度高浓度(NH4)(NH4)2 2SO4SO4中和蛋白质表面电中和蛋白质表面电 荷荷, ,使同电相斥作用减小使同电相斥作用减小凝聚凝聚沉淀沉淀2.2.Ⅳ酶的提取与分离纯化二二 等电点法沉淀分离等电点法沉淀分离1.1.原理原理: :PH=PIPH=PI时时, ,带电量为零带电量为零, ,同电相斥作用同电相斥作用 最小最小, ,凝聚凝聚沉淀沉淀2.2.注意：注意：等电点法不破坏水膜，不一定沉等电点法不破坏水膜，不一定沉 淀，须与其他方法联合使用淀，须与其他方法联合使用Ⅳ酶的提取与分离纯化三三 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法1.1.原理原理: :有机溶剂破坏蛋白质三级结构有机溶剂破坏蛋白质三级结构, ,使非使非 极性基团外露极性基团外露, ,极性基团内藏极性基团内藏, ,使使水膜水膜 破坏破坏, ,凝聚沉淀凝聚沉淀. .Ⅳ酶的提取与分离纯化㈡㈡膜分离法膜分离法一一 压差膜法压差膜法1.1.纳滤：纳滤：2.2.微滤：微滤：3.3.超滤：超滤：Ⅳ酶的提取与分离纯化二二￿ ￿电位差膜法电位差膜法（（电渗法电渗法））1.1.定义：定义：用用两块膜两块膜把水槽分为把水槽分为三个室三个室，加空，加空 间电场，使中间室中待分离液中正、间电场，使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室负离子分别电渗到两边的两室2.2.注意：注意：正离子正离子向向靠近负极的室靠近负极的室电渗电渗 负离子负离子向向靠近正极的室靠近正极的室电渗电渗Ⅳ酶的提取与分离纯化三三 扩散膜法扩散膜法1.1.定义：定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为将待分离液装入膜袋中，膜袋外为 浓度浓度大于大于或或小于小于待分离液的溶液。

待分离液的溶液 利用浓度差使待分离液中利用浓度差使待分离液中水水、、杂质杂质 通过渗透或渗析而与通过渗透或渗析而与需要的组分需要的组分分分 离离2.2.渗透与渗析渗透与渗析⑴⑴渗透：渗透：只有溶剂透过膜只有溶剂透过膜⑵⑵渗析：渗析：有溶质透过膜有溶质透过膜Ⅳ酶的提取与分离纯化四四 膜的选择膜的选择1.1.透水率：透水率：2.2.截留率：截留率：3.3.截留物相对分子量：截留物相对分子量：Ⅳ酶的提取与分离纯化㈢离心分离㈢离心分离一一￿离心机的选择离心机的选择1.1.常速离心机：常速离心机：Vmax≤8000r/minVmax≤8000r/min；； 用于：用于：2.2.高速离心机：高速离心机：Vmax≤Vmax≤（（1-2.51-2.5））×10×104 4r/minr/min；； 用于：用于：3.3.超速离心机：超速离心机：VmaxVmax＝（＝（2.5-122.5-12））×10×104 4r/minr/min；； 用于：用于：生物大分子、生物大分子、Ⅳ酶的提取与分离纯化二二￿ ￿离心方法离心方法1.1.差速离心法：差速离心法：利用密度（质量数）不同的利用密度（质量数）不同的 物质离心速度不同而分离物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部密度大的物质在离心瓶底部 ，密度小的在上部，密度小的在上部2.2.密度梯度离心法：密度梯度离心法：Ⅳ酶的提取与分离纯化3.3.等密度离心法：等密度离心法：Ⅳ酶的提取与分离纯化㈣层析分离㈣层析分离一一￿吸附层析吸附层析1.1.原理：原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离度不同而分离2.2.常用吸附剂：常用吸附剂：Ⅳ酶的提取与分离纯化二二 分配层析分配层析1.1.原理：原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各利用吸附剂与载体的共同作用，各 物质扩散速度不同而分离，物质扩散速度不同而分离，比吸附比吸附 层析效果好层析效果好2.2.三类：三类：⑴⑴滤纸层析滤纸层析 ⑵ ⑵ ⑶ ⑶Ⅳ酶的提取与分离纯化三三 离子交换层析离子交换层析1.1.原理：原理：利用离子交换剂上柱，以利用离子交换剂上柱，以离子键离子键与待分离物与待分离物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而得到待分离物得到待分离物，离子键结合稳，效果好，离子键结合稳，效果好2.2.几个重要的离子交换剂：几个重要的离子交换剂：3.3.几个重要的洗脱剂：几个重要的洗脱剂：※※离子交换剂：离子交换剂：阴离子交换剂：阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子带正电的物质，可吸附阴离子阳离子交换剂：阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子带负电的物质，可吸附阳离子Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※层析基本操作过程层析基本操作过程层析柱层析柱的准备的准备固定相材固定相材料的准备料的准备装柱装柱平衡平衡上样上样（洗涤和）（洗涤和） 洗脱洗脱收集洗收集洗脱液脱液洗脱液检测，洗脱液检测，绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线（柱再生）（柱再生）Ⅳ酶的提取与分离纯化四四￿ ￿凝胶层析凝胶层析1.1.原理：原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利待分离液与凝胶溶液混合上柱，利 用用大分子太大，不从凝胶网孔通过大分子太大，不从凝胶网孔通过 ，而是从凝胶粒子间通过，，而是从凝胶粒子间通过，受阻力受阻力 小，沉降快小，沉降快，而，而小分子小，可从凝小分子小，可从凝 胶网孔通过，在凝胶中胶网孔通过，在凝胶中受阻力大受阻力大，， 沉降慢沉降慢而分离而分离分子大小差距大的物分子大小差距大的物 质质2.2.几种常用凝胶：几种常用凝胶：Ⅳ酶的提取与分离纯化五五￿ ￿亲和层析亲和层析1.1.原理：原理：固定相上柱成母体，再用固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母母体活化剂为母 体引入活泼基团，体引入活泼基团，使母体以使母体以共价键共价键与待分与待分 离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，母母 体与待分离物结合稳，效果好体与待分离物结合稳，效果好2.2.固定相：固定相：3.3.母体活化剂：母体活化剂：※※母体：母体：上柱的载体上柱的载体 配体：配体：待分离物待分离物 固定相：固定相：同母体同母体 Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※亲和层析操作过程亲和层析操作过程•固定相选择固定相选择Ⅳ酶的提取与分离纯化•固定相活化固定相活化Ⅳ酶的提取与分离纯化•层析过程层析过程层析柱层析柱的准备的准备固定相材固定相材料的准备料的准备装柱装柱平衡平衡上样上样（洗涤和）（洗涤和） 洗脱洗脱收集洗收集洗脱液脱液洗脱液检测，洗脱液检测，绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线（柱再生）（柱再生）下一轮下一轮上样上样Ⅳ酶的提取与分离纯化㈤电泳分离㈤电泳分离 ※※原理原理 电泳速率只与电泳速率只与Q Q、、r r有关（有关（电荷效应电荷效应、、分子分子筛效应筛效应），而），而Q Q与与PHPH有关（有关（PHPH趋近趋近PIPI时时Q Q最最小，反之同理小，反之同理），），r r与与M M有关（有关（M M大则大则r r大，大，反之同理反之同理））※ ※ 支持物要求支持物要求均匀、阻力小均匀、阻力小Ⅳ酶的提取与分离纯化※￿※￿电泳方法及原理电泳方法及原理一一 纸电泳纸电泳二二 薄层电泳薄层电泳三三 薄膜电泳薄膜电泳Ⅳ酶的提取与分离纯化四四 凝胶电泳（凝胶电泳（比凝胶层析效果好比凝胶层析效果好））1.1.凝胶的组成与制作凝胶的组成与制作 组成：组成：单体单体+ +交联剂交联剂+ +催化剂催化剂 制作：制作：三种成分混合溶解即可三种成分混合溶解即可2.2.单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系 单体浓度单体浓度↑↑→→网孔大小网孔大小↓↓ 交联剂浓度占交联剂浓度占5%5%→→网孔最小网孔最小3.3.连续凝胶电泳三连续：连续凝胶电泳三连续：单体浓度、单体浓度、PHPH、缓、缓冲液冲液连续连续Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※不连续凝胶电泳不连续凝胶电泳1.1.三个不连续：三个不连续：单体浓度、单体浓度、PHPH、缓冲液不连、缓冲液不连 续续2.2.三种效应：三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩电荷效应、分子筛效应、浓缩 效应效应3.3.三层：三层：样品胶层：样品胶层：最上层，与样品混合最上层，与样品混合 浓缩胶层：浓缩胶层：样品大多因分子太大浓样品大多因分子太大浓 缩于此缩于此 分离胶层：分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层，需分离出的样品通过浓缩层， 聚集于分离胶层聚集于分离胶层※※不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳效果好不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳效果好Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※浓度梯度凝胶电泳浓度梯度凝胶电泳1.1.定义：定义：上面单体浓度小，网孔大；往下单上面单体浓度小，网孔大；往下单 体浓度依次增大，网孔依次变小，体浓度依次增大，网孔依次变小， 增大了分子筛效应，增大了分子筛效应，比连续凝胶电比连续凝胶电 泳效果好泳效果好2.2.特点：特点：分子筛效应大于电荷效应，为主要分子筛效应大于电荷效应，为主要 效应效应3.3.作用：作用：不同质量数的物质聚于不同的胶层不同质量数的物质聚于不同的胶层 ，，M M大的聚于上层，大的聚于上层，M M小的聚于下层小的聚于下层 可用于测可用于测/ /比较比较M MⅣ酶的提取与分离纯化※SDS-PAGE※SDS-PAGE（（1.1.电泳速度只与网孔大小（电泳速度只与网孔大小（分子筛效应分子筛效应）有）有 关原因关原因 SDS SDS与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为1818埃埃左右，长轴与左右，长轴与M M有关：有关：M M越大越大→→长轴越长轴越长，长，长度差距很大，长度差距很大， M M越大越大→→长轴越长，长轴越长，在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小Ⅳ酶的提取与分离纯化2.2.作用：作用：测测M MM M与电泳速率有关：与电泳速率有关：可以通过测电泳速率得可以通过测电泳速率得M MⅣ酶的提取与分离纯化※ ※等电点聚焦电泳等电点聚焦电泳1.1.原理：原理：两性离子载体加入到电泳池中，两两性离子载体加入到电泳池中，两 电极通电后，正极到负极电极通电后，正极到负极PHPH依次增依次增 大，不同蛋白质大，不同蛋白质PIPI不同，不同，PH=PIPH=PI时的时的 地方该蛋白质带电量为零，聚集于地方该蛋白质带电量为零，聚集于 此，此，可用于分离不同的蛋白质可用于分离不同的蛋白质2.2.两性离子载体：两性离子载体：Ⅳ酶的提取与分离纯化㈥萃取分离㈥萃取分离一一￿有机萃取有机萃取1.1.原理：原理：利用不同物质在有机溶剂中溶解度利用不同物质在有机溶剂中溶解度 不同而分离不同而分离2.2.作用：作用：用于分离有机物与无机物用于分离有机物与无机物Ⅳ酶的提取与分离纯化二二￿ ￿双水相萃取双水相萃取1.1.双水相的制备方法双水相的制备方法高聚物与高聚物：高聚物与高聚物：相互有排斥力，不成单相相互有排斥力，不成单相高聚物与无机盐：高聚物与无机盐：有机物与无机物不成一相有机物与无机物不成一相2.2.原理：原理：利用不同物质在双水相中溶解度不利用不同物质在双水相中溶解度不 同而分离同而分离3.3.优点：优点：可直接从细胞中提取酶，不用处理可直接从细胞中提取酶，不用处理 细胞残片；可室温下操作，利于工细胞残片；可室温下操作，利于工 业化生产业化生产Ⅳ酶的提取与分离纯化三三 超临界萃取超临界萃取1.1.原理：原理：超临界流体作萃取剂，利用不同物超临界流体作萃取剂，利用不同物 质在超临界流体中溶解度不同而分质在超临界流体中溶解度不同而分 离离2.2.超临界流体：超临界流体：T T、、P P超过临界值形成的流体超过临界值形成的流体 ，性质介于气相与液相之间，性质介于气相与液相之间3.CO3.CO2 2作萃取剂原因：作萃取剂原因：COCO2 2临界点易达到，临界点易达到， COCO2 2 的超临界流体易制取的超临界流体易制取4. CO4. CO2 2作萃取剂优点：作萃取剂优点：COCO2 2无毒、不腐蚀、价格低无毒、不腐蚀、价格低 、可循环利用、可循环利用Ⅳ酶的提取与分离纯化四四 反胶束萃取反胶束萃取1.1.原理：原理：利用正胶束与反胶束转换分离出酶利用正胶束与反胶束转换分离出酶2.2.定义定义表面活性剂：表面活性剂：极性基团与非极性基团组成的有机物极性基团与非极性基团组成的有机物正胶束：正胶束：表面活性剂在水等极性溶剂中极性基团在表面活性剂在水等极性溶剂中极性基团在 外形成的胶束外形成的胶束反胶束：反胶束：表面活性剂在有机溶剂等非极性溶剂中非表面活性剂在有机溶剂等非极性溶剂中非 极性基团在外形成的胶束极性基团在外形成的胶束3.3.萃取过程：萃取过程：表面活性剂加入到发酵液中，形成反胶束，蛋表面活性剂加入到发酵液中，形成反胶束，蛋 白质溶于水进入反胶束极性中心，再把反胶束白质溶于水进入反胶束极性中心，再把反胶束 转入水中形成正胶束，极性中心外露，蛋白质转入水中形成正胶束，极性中心外露，蛋白质 溶于水溶于水Ⅳ酶的提取与分离纯化※ ※几个英语单词的意思几个英语单词的意思Ⅳ酶的提取与分离纯化Ⅳ酶的提取与分离纯化Ⅳ酶的提取与分离纯化。