包涵体变性、复性及纯化.docx

一、菌体的裂解 1、如何裂解细菌？ 细胞的破碎措施 1.高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处,开动开关后，逐渐加速至所需速度此法合用于动物内脏组织、植物肉质种子等 ﻫ2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨,上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎限度比高速组织捣碎机为高,合用于量少和动物脏器组织 ﻫ3.超声波解决法：用一定功率的超声波解决细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多合用于微生物材料，用大肠杆菌制备多种酶,常选用5０-１０0毫克菌体/毫升浓度,在1KＧ至10ＫG频率下解决１0-15分钟，此法的缺陷是在解决过程会产生大量的热,应采用相应降温措施,时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调节,超声完全了菌液应当变清亮，如果不放心可以在显微镜下观测对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用 4.反复冻融法：将细胞在-20度如下冰冻,室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞构造破碎 ﻫ5.化学解决法：有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶解决效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。

 无论用哪一种措施破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸(DＦP)可以克制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以克制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物(PＭSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是所有,并且应当在破碎的同步多加几次；此外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取 这是原则配方:ﻫ裂解液:５0mＭ Tｒｉｓ-HCl(pH8．5~９.０), 2mＭ EDTＡ， １0０ｍM NaCl, 0.５% Triｔon X－1００, 1mg/ml溶菌酶溶菌酶在这个pH范畴内比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,并且蛋白的分子量又不不小于20kd的话，尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的原则是,溶液很粘.ﻫpｒotｏcｏl是１0ml-5０mｌ缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1ｇ湿菌体.ﻫ如果只做一种鉴定,我觉得10０－200ml菌就够了.但凡超声,我都用６0ml裂解液,由于我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用１0０ml小烧杯,装60ｍｌ裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.ﻫ沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用４M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用８M尿素溶解后来,离心取上清，加入适量体积的loａdinｇ buffer．lｏaｄｉng buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的."取2００微升菌液,离心后直接加上样ｂufｆeｒ，100度3分钟后上样,然后SDSPAGE. 这个措施究竟能不能溶解细菌中的包涵体? ＂ﻫ而楼主的问题,虽然loading buｆfer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无体现，用loading buffeｒ是没有问题的. ﻫ2、体现重组蛋白时，细菌裂解措施均有哪些？ 在体现重组蛋白时，诱导后来跑SDＳ-ＰＡGE发现体现都较好，但是在裂解细胞时遇到问题。

总是不能彻底裂解细胞 一方面我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解 我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪,功率４00W，超5秒,间隔5秒，反复9９次然后显微镜观测,不彻底时再反复9９次菌体来自200 ｍｌ培养液，用20 ml PＢS重悬 ﻫ然后我又尝试加溶菌酶，一方面加至终浓度100 uｇ/ml,４C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 ｍｇ/ｍl,半小时后仍无明显变化由于我用的PBS是ｐH７.4，我怀疑是pH不合适,换用ｐH８.0 TE ｂｕｆｆer,１ mg/ml溶菌酶,４C半小时仍无明显变粘由于这次使用的溶菌酶是前一天配好的，紧张溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化 ﻫ真是郁闷究竟出了什么事?请高手解答，并简介优化的方案 同步但愿能简介一下如何选择细胞破碎措施，以及如何拟定最佳条件 ﻫ溶菌酶在pH7．4时与否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶,如果可以，应如何保存？ ﻫ加入溶菌酶后来，如果细胞壁已破坏，菌液应当变粘吧,由于核酸被释放出来 ﻫ而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的,由于超声可以把大分子核酸打碎成小片段 我判断细胞破碎不完全是由于,在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS－PAＧE观测，发目前细胞碎片组分中除了常常浮现的一两条带以外，尚有菌体总蛋白样品中的诸多带浮现。

据此可以判断细胞只是部分破碎 ﻫ不知我的分析与否对的，请版主和各位高手指教 如果溶菌酶效果还可以,我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以减少粘度的细胞破碎方略也许比较好由于超声有也许使蛋白变性，但单用溶菌酶不能拟定与否完全破碎,还要再加核酸酶减少粘度这种两步法方略应当还可以减少破碎条件优化的时间 我用的溶菌酶放置时间比较长了,有也许失活了我刚从生工又定了一支，但是得后天到货,但愿它有用 ﻫ如何观测溶菌酶与否已裂解细胞,通过观测粘度变化与否可以？ ﻫ只反复冻融与否可以有效裂解大肠杆菌细胞? ﻫ溶菌酶只有在pH值不小于8.0的条件下才干发挥溶菌作用，请务必保持ＰBS的pH＞8.0，同步溶菌酶的量一定要足！ ﻫ在加入溶菌酶后,最佳放于磁力搅拌器上搅拌30分钟,再进行超声破菌，我的超声条件是：功率４00W，工作2秒,间隔2秒，反复１99次菌体来自５00 ml培养物，用30 ml ＰＢS重悬,超声效率还是可以的 哪儿的溶菌酶好用? 我用生工的溶菌酶,称取干粉２０mg200ml菌液用１８ ｍｌ ＮaCl重悬，加入２ ml ２５mM Ｔris-HCｌ(pＨ8.0),将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pＨ减少到5－6,加２0 ul 2Ｍ Ｔriｓ碱,体系ｐH升到~8。

4C放置1小时，菌液上层变澄清,摇动发现体系没有变粘测pH仍在8左右再３７C保温１小时,还没有变化，我简直不知如何才好了 ﻫ另一瓶２00mｌ培养物，溶菌酶解决1小时后超声条件:3０0W,超5秒停５秒，反复9９次菌液有变化，但很不明显继续超声４00次，从外观来看没有太大区别我简直要说tｍd了 我的操作有什么地方不当当,请各位指正 溶菌酶的厂商规定与否很重要？ 我的诱导物来自1:２0过夜培养物接种，37C生长3小时后3０C诱导2小时(0.8mM IPTG) ﻫ与否菌液太浓,Phaｒmacｉａ的阐明书200 ml培养物用1０ mｌ重悬，我用20 ｍｌ，仍然不够稀？有人告诉我菌液应当稀某些,2００ ml用30－４0 ｍl重悬但实际操作也不够抱负 SDＳ-PＡGＥ总是观测到细胞破碎效果不够彻底超声那么多次,蛋白都要被超碎变性了 ﻫﻫ３、酵母的破碎 ﻫ酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分与否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的我归纳了一下，做破碎酵母的几种措施: ﻫ１ 机械的措施:一般的PRＯTOCOL都是用ｇlａss beads:如 sｉgma Ｇ-8７７2，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。

 2 化学裂解的措施：1０ｇ酵母 加１ｍl的乙酸乙酯，充足搅拌至液体状(但愿高手点评） ﻫ３ 尿素裂解液(尿素8moｌ/L, ＮaCl 0．5mol／L,Trｉs 20ｍmol/L， EＤTＡ 20mmol/L， ２%ＳＤS, PH值８.0）高压匀浆这个好象也该在措施２中) ﻫ4 液氮冻融并研磨酵母破壁,我觉得这种也许在小试中比较合适 ﻫ5 温和的酶法,也许不会会破坏酵母原生质体 ﻫ酶法裂解重要用两种酶:1蜗牛酶,可以直接从蜗牛的胃液中获得;２lyｔｉcａse,可以从sigma定购这两种酶解法都可以和上面的几种措施结合使用,特别是gｌass beａds措施，效果较好 我用过化学裂解的措施，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,充足搅拌至液体状此法的裂解效果不错的，不妨试一下 ﻫ一篇文章是加尿素裂解液（尿素８mol/L, NaCｌ 0.5ｍol/Ｌ，Tris 20mmoｌ/Ｌ, EDTA 20mｍol/L, ２%SＤS, PＨ值８．0)，据说效果可以 酵母破碎效果好的我所做过的措施中还是玻璃珠,就象mｉcrobｅ 和roｎｇjuｎｌｉ所说的那样,效率很高的，并且对目的蛋白活性不会有什么影响一般应当用这个措施。

 ﻫﻫ4、超声破碎的条件选择 ﻫ超声破碎的条件不能一概而论,要看你的实验规定,有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时,每次超声时间可缩短,不能让温度升高,必要时在冰浴条件下进行超声破碎至于每次超声时与否起泡沫到不是核心的问题，这与你超声的量明显有关 ﻫ５、如何鉴定细菌超声破碎的限度 ﻫ最简朴的措施:涂片－-革兰氏结晶紫溶液染色０.5分钟---显微镜观测 牢记:只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下  ﻫﻫ6、细菌裂解的DNaseＩ不同纯度的酶换算原则不同，因此你最佳查查是哪个公司的酶？仔细看阐明书，也许会有换算阐明 此外看一下参照文献所用的酶是哪个公司的,到该公司的主页也也许有收获 ﻫ我用过华美和TＡKARA的DNA酶，华美的是用ｍg/ml华美也有RＮaｓe free的DＮＡ酶,定量用活性单位TAKARＡ的两种酶都是用活性单位定量的 ﻫ我在超声裂解细菌时加入某些DNA酶,一般用超声液加不同量的酶做一种预实验，选用符合你需要的酶量 其实根据目的和措施的不同,所需要的酶量也是可调节的,例如酶切温度（１６度或37度) 7、超声裂解细菌与否完全？ 最简朴的措施：涂片-－革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观测 ﻫ牢记:只用结晶紫染色 ﻫ二、包涵体的洗涤 ﻫ1、包涵体的洗涤问题 一般的洗涤措施一般是洗不干净的,我此前是这样做的，先把包涵体用6Ｍ盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M，离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以始终稀释到合适的浓度，你可以找到一种合适清除杂质的措施,其实这就是梯度沉淀的措施，我觉得比一般的直接洗脱效果好。

 ﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解的就是你的目的蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目的蛋白弄丢了 此外刚解决完的包涵体好溶解冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂如果说是不少不溶解的不是你要的,那就不用管了 ２、如何得到比较纯的包涵体 对于包涵体的纯化，包涵体的前解决是很重要的 包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质洗涤常用1％如下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Ｌubel和 NＰ40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTＴ)、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加５0 mM NaＣL这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上,并且可保持元构造也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EＤＴA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜,使用的还原剂为0.1-5ｍMEDTA为0.1-0．3 mM去垢剂如Triton X-１00、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充足洗涤清除杂。