种质离体保存.ppt

7 种质离体保存种质离体保存•种质：亲代通过生殖细胞或体细胞种质：亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质传递给子代的遗传物质•种质保存主要有两种方式：原地保存和种质保存主要有两种方式：原地保存和异地保存异地保存•离体保存：将组织培养中的外植体或试离体保存：将组织培养中的外植体或试管苗储存在使其抑制生长、缓慢生长或管苗储存在使其抑制生长、缓慢生长或无生长的条件下，以达到长期保存的目无生长的条件下，以达到长期保存的目的•7.1 常温保存常温保存• 在在20—25度长温下，通过改变度长温下，通过改变培养基中某些营养物质的浓度，培养基中某些营养物质的浓度，改变培养的环境条件，从而达到改变培养的环境条件，从而达到种植保存的目的种植保存的目的•7.2 常低温和低温保存常低温和低温保存•常低温：常低温：0 —15度；度；•低温：低温： –80 — 0度• 根据不同植物对低温的耐受力确根据不同植物对低温的耐受力确定其抑制生长的保存温度；在低温定其抑制生长的保存温度；在低温保存时可结合低温来取得更好的效保存时可结合低温来取得更好的效果•7.3 超低温冷冻保存种质超低温冷冻保存种质 • 超低温保存也叫冷冻保存，超低温保存也叫冷冻保存，在在–196度的超低温下使细胞代度的超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态。

谢和生长处于基本停止的状态•7.3.1 超低温冷冻保存种质的方法超低温冷冻保存种质的方法•超低温保存超低温保存: 将离体培养的茎尖分生组织、愈将离体培养的茎尖分生组织、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体经冷冻防护伤组织、悬浮培养细胞、原生质体经冷冻防护剂处理后放入剂处理后放入–196度的液氮罐或库中保存度的液氮罐或库中保存• 常用的冷冻防护剂：甘油、甘露醇、脯氨酸、常用的冷冻防护剂：甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亚枫，使用浓度二甲基亚枫，使用浓度5%—10%•7.3.2 超低温冷冻保存种质超低温冷冻保存种质 的的原理原理•(1) 冷冻防护剂属于低分子中性物质，与水溶冷冻防护剂属于低分子中性物质，与水溶液发生水合作用而增加黏度，使溶液冰点下降；液发生水合作用而增加黏度，使溶液冰点下降；•(2) 使用冷冻防护剂可提高培养基的渗透压，使用冷冻防护剂可提高培养基的渗透压，导致细胞发生轻微质壁分离，从而提高组织和导致细胞发生轻微质壁分离，从而提高组织和细胞的抗寒力；细胞的抗寒力；•(3) 二甲基亚枫还易渗入细胞内部，可防止细二甲基亚枫还易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时因过度脱水而遭破坏。

胞在冷冻和融冰时因过度脱水而遭破坏•7.3.3 7.3.3 超低温冷冻保存种质超低温冷冻保存种质的程序的程序•(1) 预培养预培养•(2) 冷处理冷处理•(3) 降温冷冻及超低温保存降温冷冻及超低温保存•(4) 解冻解冻•(5) 再培养再培养•(6) 生活率及成活率测定生活率及成活率测定•7.3.4 超低温冷冻保存种质超低温冷冻保存种质 的应用前景的应用前景8.8. 植物遗传转化植物遗传转化•植物遗传转化指将外源基因转移植物遗传转化指将外源基因转移到植物体内并稳定地整合表达与到植物体内并稳定地整合表达与遗传的过程遗传的过程•遗传转化方法主要有遗传转化方法主要有: :农秆菌介导法、农秆菌介导法、基因枪法、电击法、聚乙二醇法等基因枪法、电击法、聚乙二醇法等等•8.1 8.1 植物遗传转化的受体系统植物遗传转化的受体系统•概念：指用于基因转化的外植体通过组概念：指用于基因转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外高效、稳定地再生无性系，并能接受外源源DNADNA整合，转化选择对抗生素敏感的再整合，转化选择对抗生素敏感的再生系统。

生系统•选择和建立良好的植物受体系统是遗传选择和建立良好的植物受体系统是遗传转化能否成功的关键因素之一转化能否成功的关键因素之一•8.1.1 8.1.1 原生质体受体系统原生质体受体系统•原生质体受体系统有原生质体受体系统有5 5个方面的个方面的特点特点: :•8.1.2 8.1.2 愈伤组织受体系统愈伤组织受体系统• 愈伤组织是植物基因转化常用的愈伤组织是植物基因转化常用的受体系统之一受体系统之一, ,该系统的特点表现有该系统的特点表现有五个方面五个方面•8.1.3 8.1.3 种质系统种质系统•种质系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、种质系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统•种质系统表现为种质系统表现为3 3个方面的特点个方面的特点•8.1.4 8.1.4 胚状体受体细胞胚状体受体细胞•8.1.5 8.1.5 直接分化芽受体系统直接分化芽受体系统• 直接分化芽指外植体细胞进直接分化芽指外植体细胞进行组织培养时行组织培养时, ,越过愈伤组织阶越过愈伤组织阶段而直接分化形成的不定芽段而直接分化形成的不定芽。

•8.2 8.2 农杆菌介导的植物基因转农杆菌介导的植物基因转• 化技术化技术•研究表明研究表明: :根癌农杆菌细胞中存在一种根癌农杆菌细胞中存在一种TiTi质质粒，该质粒的部分粒，该质粒的部分DNADNA片段可整合到宿主植片段可整合到宿主植物基因组中，与宿主植物基因组一起表达物基因组中，与宿主植物基因组一起表达整合到宿主植物基因组的整合到宿主植物基因组的TiTi质粒质粒DNADNA片段携片段携带有生长素、细胞分裂素和合成冠瘿碱等带有生长素、细胞分裂素和合成冠瘿碱等基因从而使被根癌农杆菌侵染过的植物基因从而使被根癌农杆菌侵染过的植物组织产生冠瘿瘤，并大量合成冠瘿碱组织产生冠瘿瘤，并大量合成冠瘿碱•冠瘿碱又反过来促进根癌农杆菌冠瘿碱又反过来促进根癌农杆菌的繁殖和的繁殖和Ti质粒的转移，扩大侵质粒的转移，扩大侵染范围 •这是自然界存在的天然植物基因这是自然界存在的天然植物基因转化系统转化系统•8.2.1 Ti质粒的结构和功能质粒的结构和功能•Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链一种环状双链DNA分子分子,长约长约200kb,平平均周长均周长54.1—75.4微米。

微米•结构：结构： TiTi质粒上有二个主要区域：即质粒上有二个主要区域：即T-DNAT-DNA区域和区域和virvir区域 TiTi质粒上还具质粒上还具有质粒复制起始位点和冠瘿碱分解代有质粒复制起始位点和冠瘿碱分解代谢酶基因位点谢酶基因位点•8.2.2 Ti8.2.2 Ti质粒载体系统质粒载体系统• TiTi质粒是植物基因工程的一质粒是植物基因工程的一种有效的天然载体种有效的天然载体, ,但野生型但野生型TiTi质粒直接作为植物基因工程载体质粒直接作为植物基因工程载体却存在一些缺陷却存在一些缺陷•8.2.3 Ti8.2.3 Ti质粒介导的遗传转化方法质粒介导的遗传转化方法•（（1 1）叶盘法）叶盘法• 方法方法: :将实验材料切成将实验材料切成2—5mm2—5mm的圆形小片的圆形小片( (叶叶盘盘) )，放入工程农杆菌培养液中浸泡，放入工程农杆菌培养液中浸泡4—5min4—5min，，使根癌农杆菌侵染叶盘再用滤纸吸干叶使根癌农杆菌侵染叶盘再用滤纸吸干叶盘上的多余菌液，将经处理的叶盘放在培养盘上的多余菌液，将经处理的叶盘放在培养皿的滤纸上培养皿的滤纸上培养2d2d后，再转移到含适当抗生后，再转移到含适当抗生素的培养基上继续培养及接种。

素的培养基上继续培养及接种• 特点：有很高的重复性，便于大量常规特点：有很高的重复性，便于大量常规地培养转化植物地培养转化植物 操作步骤如下：操作步骤如下： ① ① 无菌受体材料的选择无菌受体材料的选择 ② ② 受体材料预处理受体材料预处理 ③ ③ 供体菌株培养供体菌株培养 ④ ④ 侵染侵染 •  ⑤⑤共培养共培养 ⑥ ⑥选择培养选择培养 ⑦ ⑦继代与生根培养继代与生根培养 ⑧ ⑧抗性再生幼苗的移植抗性再生幼苗的移植转基因蓝玫瑰转基因蓝玫瑰• 转基因荧光鸡转基因荧光鸡 转基因荧光猪转基因荧光猪（（2）原生质体共培养转化法）原生质体共培养转化法•特点特点: : 所得到的转化体不含嵌合所得到的转化体不含嵌合体体, ,一次可以处理多个细胞一次可以处理多个细胞, ,能获能获得较多的转化体得较多的转化体•（（3 3）整）整株株感染法感染法• 用刀切或针刺等方法在幼嫩用刀切或针刺等方法在幼嫩植株上造成伤口，将含有重组质植株上造成伤口，将含有重组质粒的根癌农杆菌直接涂抹在植物粒的根癌农杆菌直接涂抹在植物伤口，从而进行遗传转化的简单伤口，从而进行遗传转化的简单易行的方法。

易行的方法•8.2.4 发根农杆菌发根农杆菌Ri质粒介导的质粒介导的基因转化基因转化•发根农杆菌从植物伤口入侵后不是诱发根农杆菌从植物伤口入侵后不是诱发植物细胞产生冠瘿瘤发植物细胞产生冠瘿瘤, ,而是产生许多而是产生许多不定根不定根, , 不定根迅速生长，不断分枝不定根迅速生长，不断分枝成毛状•研究表明：发状根的形成是由存在于研究表明：发状根的形成是由存在于发根农杆菌细胞中的发根农杆菌细胞中的RiRi质粒所决定的质粒所决定的（（1 1）） RiRi质粒及质粒及RiRi质粒载体质粒载体•RiRi质粒与质粒与TiTi质粒相似，均属于巨大质质粒相似，均属于巨大质粒，其大小为粒，其大小为200—800kb200—800kb；；均含有均含有T-T-DNADNA和和VirVir区，具有较高的同源性区，具有较高的同源性2 2）发根农杆菌基因转化的方）发根农杆菌基因转化的方法法•8.3 DNA8.3 DNA直接导入的遗传转化直接导入的遗传转化• 技术技术• DNADNA直接导入的遗传转化技术直接导入的遗传转化技术指不依赖于农杆菌载体和其他生指不依赖于农杆菌载体和其他生物媒体物媒体, , 将特殊处理的外源目的将特殊处理的外源目的基因直接导入植物细胞，而实现基因直接导入植物细胞，而实现基因转化的技术。

基因转化的技术•DNADNA直接导入分为化学法和物直接导入分为化学法和物理法两类理法两类•（（1 1））PEGPEG介导的遗传转化介导的遗传转化•（（2 2）基因枪法）基因枪法。