益气活血中药延缓血管老化的作用与机制研究.ppt

益气活血中药延缓血管老化的益气活血中药延缓血管老化的作用与机制研究作用与机制研究中国中医科学院中国中医科学院   雷雷 燕燕  陈可冀陈可冀 等等973项目分课题之一项目分课题之一1研究背景研究背景•血管老化（血管老化（vascular agingvascular aging））分为随增龄所致的生理性血分为随增龄所致的生理性血管老化和各种疾病引起的病理性血管老化，均表现管老化和各种疾病引起的病理性血管老化，均表现血管血管在在形态和功能上形态和功能上发生各种衰老变化，如发生各种衰老变化，如僵硬度增加、顺应性僵硬度增加、顺应性降低和动脉管壁增厚、降低和动脉管壁增厚、血管内皮功能低下血管内皮功能低下等等•血管老化血管老化是人体衰老的关键始发因素，也是老龄人群心血是人体衰老的关键始发因素，也是老龄人群心血管疾病风险增加的主要原因管疾病风险增加的主要原因•衰老的过程其实是一个动脉进行性硬化的过程，衰老的过程其实是一个动脉进行性硬化的过程，动脉硬化动脉硬化是衰老的根本原因，对衰老起决定因素的是血管而非年龄是衰老的根本原因，对衰老起决定因素的是血管而非年龄2研究背景•目前目前我国老龄人口比例以每年我国老龄人口比例以每年3%3%的速度递增的速度递增, ,老龄人群具有老龄人群具有心脑血管病发病率高的特点，心脑血管病发病率高的特点，高血压病、冠心病、心功能高血压病、冠心病、心功能不全、脑卒中等发生率随增龄急剧上升，均存在着明显的不全、脑卒中等发生率随增龄急剧上升，均存在着明显的心血管老化的表现心血管老化的表现，即心血管系统结构和功能发生特征性，即心血管系统结构和功能发生特征性改变改变•随增龄出现的血管老化随增龄出现的血管老化问题已成为研究心血管病危险因素问题已成为研究心血管病危险因素及防治的新靶点，开展及防治的新靶点，开展心血管衰老的中医药干预研究心血管衰老的中医药干预研究，对，对延缓血管老化，防治心脑血管疾病具有重要意义延缓血管老化，防治心脑血管疾病具有重要意义3Ø血管老化属于血管老化属于血管病变血管病变的一种，可由增龄、高脂饮食、运动的一种，可由增龄、高脂饮食、运动减少、高血压、糖尿病、肥胖等原因引起，老化的血管病理减少、高血压、糖尿病、肥胖等原因引起，老化的血管病理学表现为血管内膜增厚、血管硬化和动脉血压改变学表现为血管内膜增厚、血管硬化和动脉血压改变Ø随着对血管病变认识的深入随着对血管病变认识的深入, 已知血管壁病变而不是管腔病已知血管壁病变而不是管腔病变的发生发展才是各种心血管事件发生的基础；变的发生发展才是各种心血管事件发生的基础；在细胞和分在细胞和分子水平，血管老化表现在血管内皮细胞、平滑肌细胞和胞外子水平，血管老化表现在血管内皮细胞、平滑肌细胞和胞外基质水平的改变基质水平的改变Ø血管老化改变了各种心血管疾病的病理生理机制，从而改变血管老化改变了各种心血管疾病的病理生理机制，从而改变了疾病了疾病发发生的阈值、严重程度和预后生的阈值、严重程度和预后老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述老龄及血管老化概述血管老化与血管病变血管老化与血管病变4血管老化de主要表现p脉搏波速度脉搏波速度(PwV) 是评价血管硬度的较好指标是评价血管硬度的较好指标p脉压增大脉压增大是反映血管硬化的一项重要指标是反映血管硬化的一项重要指标p颈总动脉内径颈总动脉内径反映血管壁弹性与伸展性随年龄而下降反映血管壁弹性与伸展性随年龄而下降,是衰老的标志是衰老的标志p踝臂指数踝臂指数(ABI)作为评估血管功能的指标，其降低反映作为评估血管功能的指标，其降低反映ASp晚期糖基化终产物晚期糖基化终产物(AGE)随增龄在体内积累，是老年病的病理基础之一随增龄在体内积累，是老年病的病理基础之一p活性氧活性氧(ROS)水平异常增高在介导血管衰老中居于重要的地位水平异常增高在介导血管衰老中居于重要的地位p肾素肾素-血管紧张素系统血管紧张素系统(RAS) 调节血管细胞的凋亡、调节血管细胞的凋亡、VSMC 迁移、炎性反迁移、炎性反应及应及ECM重建等，重建等，AngⅡⅡ是是RAS的功能多肽的功能多肽p基质金属蛋白酶（基质金属蛋白酶（MMP-2)与其抑制剂与其抑制剂(TIMP-2) 比值的调节可以控制血管比值的调节可以控制血管重构的发生、发展重构的发生、发展5中医学对血管衰老的认识中医学对血管衰老的认识u认为虚损致衰。

气（肾）虚夹瘀阻络是血管衰老的基本病认为虚损致衰气（肾）虚夹瘀阻络是血管衰老的基本病机；延缓衰老应机；延缓衰老应补虚祛瘀法并用补虚祛瘀法并用u心血管疾病的基础病变和共同归路是血管老化，也是多种心血管疾病的基础病变和共同归路是血管老化，也是多种血管病变在血管病变在“入络入络”阶段异病同治的病理基础阶段异病同治的病理基础u益气活血药人参、三七是常见的具有抗衰老作用的天然药益气活血药人参、三七是常见的具有抗衰老作用的天然药物，均富含三萜类达玛烷型皂甙，国内外药理研究已证实物，均富含三萜类达玛烷型皂甙，国内外药理研究已证实此类有效成分有抗衰老作用，可达到益气活血，祛瘀生新，此类有效成分有抗衰老作用，可达到益气活血，祛瘀生新，通脉活络的作用通脉活络的作用6研究目的研究目的u以以自然衰老自然衰老小鼠为模型，观察衰老小鼠血管老化所导致小鼠为模型，观察衰老小鼠血管老化所导致血管壁结构和功能的改变，血管壁结构和功能的改变，阐明血管衰老的可能机制阐明血管衰老的可能机制u通过复制通过复制内皮细胞内皮细胞( EC) 模型，揭示血管细胞衰老机制模型，揭示血管细胞衰老机制u观察益气活血中药能否通过产生观察益气活血中药能否通过产生ROS的的NADPH氧化酶氧化酶亚单位亚单位p47phox的途径的途径延缓血管老化延缓血管老化u揭示揭示益气活血益气活血中药中药人参三七川芎人参三七川芎提取物延缓血管老化的提取物延缓血管老化的作用和机制作用和机制7研究方法研究方法•模型：模型：健康雄性健康雄性自然衰老小鼠自然衰老小鼠，，14月龄，月龄，70只只                                复制复制衰老血管内皮细胞衰老血管内皮细胞（（EC）模型）模型•分组：分组：衰老模型组、人参三七川芎高、中、低剂量组、衰老模型组、人参三七川芎高、中、低剂量组、               维生素维生素E组（组（VitE组）、另设青年对照组组）、另设青年对照组•给药：给药：按照小鼠和人体重剂量折算系数关系，中药大、按照小鼠和人体重剂量折算系数关系，中药大、               中、小剂量相当于临床用量的中、小剂量相当于临床用量的2倍、倍、1.5倍、倍、1倍，倍，               维生素维生素E50.0 mg/（（kg·d），），给药给药3个月个月8实验药物–中药制备：中药制备：l人参、三七、川芎人参、三七、川芎 按比例加入按比例加入3倍倍70％乙醇提取％乙醇提取3次，次，将醇提取液进行乙醇回收，浓缩至无醇味，制成中将醇提取液进行乙醇回收，浓缩至无醇味，制成中药浸膏，药浸膏，含含3.164 g生药生药/g浸膏浸膏–对照药：对照药：● 维生素维生素E 购自购自Sigma公司公司9研究内容构建自然衰老小鼠模型构建自然衰老小鼠模型观察观察行为学行为学改变改变胸主动脉胸主动脉Messon染色及羟染色及羟脯氨酸含量测定脯氨酸含量测定检测血浆检测血浆AngⅡⅡ含量含量血管组织抗超氧阴离子血管组织抗超氧阴离子糖基化终末产物（糖基化终末产物（AGEs））MMP-2/ TIMP-2比值比值人参、三七人参、三七川芎川芎 干预干预复制衰老复制衰老VEC模型模型细胞形态学观察细胞形态学观察衰老标志物衰老标志物β-gal检测；检测；激光共聚焦观察激光共聚焦观察 ROS；；MMP-9、、AGEs含量和含量和TGF-β1的表达的表达流式检测线粒体膜电位流式检测线粒体膜电位细胞周期细胞周期观察指标观察指标10益气活血药延缓血管老化的实验研究益气活血药延缓血管老化的实验研究— EC部分部分  4代代                                                           5代代                                                          7代代    8代代                                                        10代代                                                          11代代  各代内皮细胞生长状况的比较各代内皮细胞生长状况的比较  11益气活血药延缓血管老化益气活血药延缓血管老化-EC形态学观察形态学观察                 中药高剂量组中药高剂量组                                                            中药低剂量组中药低剂量组         光镜光镜 ×100     8代对照组代对照组                                                                 VitE组组 第第8代自然衰老细胞，中药高剂量和代自然衰老细胞，中药高剂量和VitE 组细胞较衰老模型组光镜下观察，组细胞较衰老模型组光镜下观察，内皮细胞生长状态好，数量较多，增殖较旺盛内皮细胞生长状态好，数量较多，增殖较旺盛12益气活血药延缓血管老化益气活血药延缓血管老化-内皮细胞内皮细胞B-gal染色染色          中药高剂量组中药高剂量组                                                            中药低剂量组中药低剂量组       光镜光镜x400          8代对照组代对照组                                                               VitE组组 8代模型衰老组表达代模型衰老组表达B-gal蓝染细蓝染细胞较多，约胞较多，约78%左右；左右；VitE组阳性细胞数约组阳性细胞数约25%左右；中药高剂量组约左右；中药高剂量组约42%左右，低剂量组约左右，低剂量组约38%左右左右13细细 胞胞 周周 期期   8代衰老组代衰老组                                                                  VitE组组           中药高剂量组中药高剂量组                                                            中药低剂量组中药低剂量组                                          14细细 胞胞 周周 期期 与与VitEVitE组比较组比较, 8, 8代衰老模型组细胞周期向代衰老模型组细胞周期向G G0 0-G-G1 1期明显停顿，期明显停顿，G G2 2-M-M期细胞明显减少；与衰老模型组比较，中药高、低剂量组及期细胞明显减少；与衰老模型组比较，中药高、低剂量组及VitVit E E组组G G0 0- G- G1 1期细胞明显减少，处于期细胞明显减少，处于G G2 2-M-M期的细胞明显增多，差异有统计学意期的细胞明显增多，差异有统计学意义；表明中药在一定程度上能够延缓细胞衰老，促进细胞增殖义；表明中药在一定程度上能够延缓细胞衰老，促进细胞增殖15益气活血药延缓血管老化益气活血药延缓血管老化-细胞内细胞内ROS含量含量（（激光共聚焦）激光共聚焦）8代模型组代模型组                                                    VitE组组              中药高剂量组中药高剂量组                                           中药低剂量组中药低剂量组          激光共聚焦激光共聚焦x100中药高、低中药高、低剂量和剂量和VitE组荧光强度组荧光强度较模型组明较模型组明显减弱；提显减弱；提示中药可通示中药可通过减少细胞过减少细胞内活性氧产内活性氧产生，延缓细生，延缓细胞衰老胞衰老16细胞培养液抗超氧阴离子与细胞培养液抗超氧阴离子与NO含量含量 8 8代衰老模型组抗超氧阴离子和代衰老模型组抗超氧阴离子和NONO含量明显减少（含量明显减少（P<0.05P<0.05）；中药高、低）；中药高、低剂量组抗超氧阴离子和剂量组抗超氧阴离子和NONO含量比衰老组明显增加，但较含量比衰老组明显增加，但较VitEVitE组含量降低，差组含量降低，差异有统计学意义。

提示异有统计学意义提示8 8代衰老代衰老ECEC抗氧化能力下降，而中药能在一定程度上改抗氧化能力下降，而中药能在一定程度上改善内皮的功能，增强抗氧化能力，从而延缓细胞衰老善内皮的功能，增强抗氧化能力，从而延缓细胞衰老17细胞细胞p47phoxp47phox、、ATAT1 1R R、、ATAT2 2R R蛋白表达蛋白表达 与与VitE组比较，组比较，8代衰老组代衰老组p47phox，，AT1R，，AT2R表达明显上调；与表达明显上调；与8代衰老组比较，代衰老组比较，中药两组与中药两组与Vit E组组p47phox表达明显下调，表达明显下调，AT1R，，AT2R表达明显下调；与表达明显下调；与Vit E组比较，组比较，中药两组中药两组p47phox，，AT2R表达上调，表达上调，AT1R表达仅有上调趋势，无明显差异表达仅有上调趋势，无明显差异18益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（1））•一般情况一般情况 •各组小鼠生活状况良好，体质量正常青年组小鼠体毛各组小鼠生活状况良好，体质量正常青年组小鼠体毛白且光泽，行动活泼，反应灵敏；其余各组小鼠体毛较白且光泽，行动活泼，反应灵敏；其余各组小鼠体毛较青年组颜色稍暗，动作稍迟缓；青年组颜色稍暗，动作稍迟缓；14月龄模型组小鼠，体月龄模型组小鼠，体毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓19益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（2）） 中药中剂量组中药中剂量组                     中药低剂量组中药低剂量组                       维生素维生素E组组     HE x100           青年对照组青年对照组                       衰老模型组衰老模型组                          中药高剂量组中药高剂量组各组小鼠主动脉形态学比较各组小鼠主动脉形态学比较 衰老模型组小鼠血管壁出现典型的衰老表现，给予中药后的小鼠血管内膜中膜增厚不明衰老模型组小鼠血管壁出现典型的衰老表现，给予中药后的小鼠血管内膜中膜增厚不明显，内皮细胞脱落减少，仅有部分平滑肌细胞向内膜迁移，衰老改变不显著显，内皮细胞脱落减少，仅有部分平滑肌细胞向内膜迁移，衰老改变不显著20益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（3）） 各组小鼠主动脉各组小鼠主动脉Masson染色结果比较染色结果比较衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓       青年对照组青年对照组                    衰老模型组衰老模型组                  中药高剂量组中药高剂量组         中药中剂量组中药中剂量组                 中药低剂量组中药低剂量组             维生素维生素E组组   Masson染色染色x100）） 21主动脉主动脉Masson 染色及染色及SMC、、CF相对含量相对含量(面积面积)比较比较 组别组别nSMC（平滑肌）（平滑肌）CF（（胶原纤维胶原纤维 ））对对照照1424.3±0.2821.6±0.40模型模型1431.9±0.86*29.9±0.80*中中药药高高剂剂量量1429.7±1.48△△24.6±0.38△△中药中药中中剂剂量量1430.5±1.4625.6±0.47△△中药中药低低剂剂量量1430.7±2.4226.1±0.53△△维维生素生素E1428.8±1.14△△24.5±0.43△△益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（4 4））注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05，下表同衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高衰老模型组小鼠血管壁平滑肌和胶原含量明显增多，给予中药后胶原增生明显减少，高剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓剂量组可使平滑肌细胞增生明显减少，衰老小鼠血管老化相对减缓22益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（5））组别组别n n血血浆浆AngAngⅡⅡ含量含量( (ngng/L)/L)血管血管组织组织抗超氧阴离子抗超氧阴离子(U/L)(U/L)对对照照1414236.45±31.12236.45±31.1297.06±3.8197.06±3.81模型模型1414166.58±28.94*166.58±28.94*59.34±4.56*59.34±4.56*中中药药高高剂剂量量1414207.98±44.05207.98±44.0580.61±2.9080.61±2.90△△中中药药中中剂剂量量1414176.40±45.49176.40±45.4969.16±3.4169.16±3.41△△中中药药低低剂剂量量1414168.61±44.44168.61±44.4465.89±4.0365.89±4.03△△维维生素生素E E1414186.84±52.76186.84±52.7681.52±4.3181.52±4.31△△各组血管组织抗超氧阴离子、血浆各组血管组织抗超氧阴离子、血浆AngⅡⅡ含量比较含量比较注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05，下表同中药灌胃后，小鼠血管组织中的抗活性氧生成能力比衰老模型组有一定程度的增强，说明益中药灌胃后，小鼠血管组织中的抗活性氧生成能力比衰老模型组有一定程度的增强，说明益气活血药可能通过减少活性氧的生成来延缓血管老化。

衰老模型组气活血药可能通过减少活性氧的生成来延缓血管老化衰老模型组AngⅡⅡ含量最低，对照组含量最低，对照组最高，说明血浆中最高，说明血浆中AngⅡⅡ含量与血管老化的关系不密切，应进一步检测血管组织中含量与血管老化的关系不密切，应进一步检测血管组织中AngⅡⅡ含含量，确定与血管老化的关系量，确定与血管老化的关系23各组血管组织中各组血管组织中AGEs含量及含量及MMP-2/TIMP-2比值比较比值比较组别组别n nAGEs(ng/mLAGEs(ng/mL) )MMPMMP－－2 (2 (ng/mLng/mL) )TIMP-2 (TIMP-2 (ng/mLng/mL) )MMP-2/TIMP-2MMP-2/TIMP-2对对照照141459.55±1.8559.55±1.85180.93±10.46180.93±10.460.64±0.0830.64±0.083286.50±28.24286.50±28.24模型模型1414215.89±1.17*215.89±1.17*246.48±5.35*246.48±5.35*0.31±0.007*0.31±0.007*794.53±25.12*794.53±25.12*中中药药高高剂剂量量1414142.57±1.28142.57±1.28△△205.51±10.36205.51±10.36△△0.50±0.0320.50±0.032△△413.14±30.21413.14±30.21△△中中药药中中剂剂量量1414152.14±1.52152.14±1.52△△222.30±6.93222.30±6.93△△0.39±0.0080.39±0.008△△565.28±20.41565.28±20.41△△中中药药低低剂剂量量1414170.54±1.66170.54±1.66△△224.79±9.54224.79±9.54△△0.36±0.0070.36±0.007△△628.58±28.17628.58±28.17△△维维生素生素E E组组1414141.29±1.59141.29±1.59△△205.19±4.14205.19±4.14△△0.51±0.0060.51±0.006△△401.95±9.58401.95±9.58△△注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05青年小鼠青年小鼠AGEs含量较少，而老年小鼠含量较少，而老年小鼠AGEs含量较多，给予中药灌胃后，老年鼠血管中含量较多，给予中药灌胃后，老年鼠血管中AGEs含量有不同程含量有不同程度的降低，说明益气活血药在一定程度上降低动脉僵硬度，从而延缓血管的老化。

而衰老模型组度的降低，说明益气活血药在一定程度上降低动脉僵硬度，从而延缓血管的老化而衰老模型组MMP-2 、、MMP-2/ TIMP-2最高，最高，TIMP-2含量最低，表明衰老小鼠已出现年龄相关的血管重构，中药各组小鼠含量最低，表明衰老小鼠已出现年龄相关的血管重构，中药各组小鼠MMP-2 、、MMP-2/ TIMP-2明显降低，表明中药可能通过抑制明显降低，表明中药可能通过抑制MMP-2生成、增强生成、增强TIMP-2的活性，减少血管壁的活性，减少血管壁EMC降降解，从而延缓血管老化解，从而延缓血管老化益气活血药延缓血管老化的整体研究（益气活血药延缓血管老化的整体研究（6））24 研究结果及进展研究结果及进展•人参三七川芎能够改善衰老小鼠主动脉形态学衰老变化，人参三七川芎能够改善衰老小鼠主动脉形态学衰老变化，降低血管组织中活性氧的生成，减少降低血管组织中活性氧的生成，减少AGEs生成，抑制生成，抑制MMP-2的活性，调节的活性，调节MMP-2/TIMP-2的平衡的平衡•人参三七川芎具有延缓血管老化的作用，可能是通过影响人参三七川芎具有延缓血管老化的作用，可能是通过影响NADPH氧化酶减少氧化酶减少ROS（活性氧）的生成，从而达到延（活性氧）的生成，从而达到延缓血管老化的目的缓血管老化的目的25结结  论论•衰老小鼠血管在结构和功能上都出现了明显的衰老改变：衰老小鼠血管在结构和功能上都出现了明显的衰老改变：血管内膜中膜增厚，管壁平滑肌和胶原含量明显增多，血血管内膜中膜增厚，管壁平滑肌和胶原含量明显增多，血管组织中管组织中AGEs含量增多，而抗活性氧生成能力降低，含量增多，而抗活性氧生成能力降低，MMP-2/ TIMP-2比值增高，表明衰老小鼠血管组织已出现比值增高，表明衰老小鼠血管组织已出现年龄相关的血管重构年龄相关的血管重构•人参三七川芎提取物能降低衰老小鼠血管的僵硬度、减少人参三七川芎提取物能降低衰老小鼠血管的僵硬度、减少血管重构，延缓小鼠血管老化的发生血管重构，延缓小鼠血管老化的发生 26下一步工作打算下一步工作打算•拟进行血管老化的临床特征调查和益气活血中药干预的基拟进行血管老化的临床特征调查和益气活血中药干预的基础研究础研究–以高血压病和糖尿病患者做为血管病变的观察对象,调研和分析血管衰老的中、西医临床特征及其相关性–从血管衰老的关键环节内皮细胞和平滑肌细胞入手，通过复制衰老细胞和衰老大鼠模型，观察血管老化的病理改变，探讨PPARγ途径对p53/p21和p16/pRb两条衰老信号通路的影响以及益气活血中药的干预作用•以期明确血管衰老的病理机制，揭示益气活血中药延缓血以期明确血管衰老的病理机制，揭示益气活血中药延缓血管老化的作用机制及靶点管老化的作用机制及靶点27Thanks!28。