细胞表面分子的检测与分析.ppt

本次实验课流程本次实验课流程n n课件讲述     40min                             n n实验演示     20minn n流式细胞仪硬件及软件介绍     30minn n上机检测     40minn n解惑答疑     15min                                                        医学结构生物学研究中心医学结构生物学研究中心 柳卫凰柳卫凰细胞表面分子的检测与分析细胞表面分子的检测与分析流式在细胞表面分子检测中的应用流式在细胞表面分子检测中的应用n n免疫细胞及其亚群的检测与功能分析免疫细胞及其亚群的检测与功能分析例如：例如：T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、细胞、DCDC细胞等细胞等n n血液系统细胞表面标志的研究血液系统细胞表面标志的研究例如：急性白血病的初步诊断与检测、例如：急性白血病的初步诊断与检测、CD34+CD34+造血干细胞研究、造血干细胞研究、血小板分析辅助诊断相关疾病等血小板分析辅助诊断相关疾病等n n细胞群体及细胞表面标志变化的监测细胞群体及细胞表面标志变化的监测例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化例如：测定因试验或临床治疗引起的某些细胞表面标志的变化n n细胞表面标志构成性质的分析细胞表面标志构成性质的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析例如：蛋白、糖蛋白、类脂结构、性质、比例的分析标本来源标本来源n n外周血外周血外周血外周血 全血溶血、全血溶血、PBMCPBMCn n骨髓穿刺液骨髓穿刺液 体液、灌洗液体液、灌洗液n n实体组织实体组织实体组织实体组织 新鲜组织、石蜡包埋样本新鲜组织、石蜡包埋样本n n培养的细胞培养的细胞培养的细胞培养的细胞 原代细胞原代细胞 细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞细胞系：贴壁细胞、悬浮细胞                一、新鲜实体组织样本的制备一、新鲜实体组织样本的制备n 酶消化法。

常用的酶类试剂：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶等n 机械法1、剪碎法 2、网搓法 3、研磨法n 化学处理法 常用试剂：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意注意：除消化过程外，其余步骤最好在4度环境下操作，提高 细胞活性 标本制备标本制备 标本制备标本制备二、全血标本的制备二、全血标本的制备 ““““ABCABCABCABC””””溶血（溶血（溶血（溶血（BeckmanBeckmanBeckmanBeckman）））） 取肝素钠抗凝的外周血100ul，荧光标记完成后，依次加入A液600ul，轻轻振荡15s；B液260ul, 轻轻振荡15s；C液100ul, 振荡10s，免洗上机检测 ““ACKACK””溶血（自配）溶血（自配） 以1：3的比例取肝素钠抗凝的外周血与ACK溶血剂混匀，室温放置10min，离心去上清，再加入溶血剂溶血，反复2～3次，至红细胞完全溶解细胞重悬后，再进行荧光标记标本制备标本制备三、外周血单个核细胞的制备外周血单个核细胞的制备（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理盐水稀释成4ml，混匀；（2）沿试管壁缓缓加入4ml淋巴细胞分离液Ficoll，勿用力过大；（3）离心2000r/min，20min，离心后分层，上层为血浆层，中层           为分离液层，底层为红细胞层；（4）用吸管将上层与中层之间的单个核细胞层吸出，用生理盐水          洗两遍，PBS重悬；（5）荧光标记。

四、贴壁细胞单细胞悬液的制备 （1）将培养细胞用0.04％EDTA或0.25％胰酶消化3～7分钟，            至光镜下见到贴壁细胞变圆还没有漂浮为止，弃消化              液，加PBS；  （2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中；  （3）离心，1000r/min，5min；  （4）加PBS洗两遍；  （5）PBS重悬，将细胞吹打均匀；  （6）荧光标记标本制备标本制备标记方法标记方法n n直接免疫荧光法直接免疫荧光法    特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单特点：操作简单、省时；特异性强；结果判断较简单n n间接免疫荧光法间接免疫荧光法    特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特点：适用范围广；抗体相对便宜；操作费时；易产生非特异性染色，结果不易判断特异性染色，结果不易判断建议只用于单标检测）建议只用于单标检测）n n直接、间接混合染色法直接、间接混合染色法    染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直染色原则：一般情况下先间接后直接，特殊情况下可先直             接标记对照设置对照设置n n阴性对照阴性对照        调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值。

调节荧光探测器放大倍数，确定带测标本的基础荧光域值常用的有：常用的有：同型对照同型对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照、封闭抗体对照、阴性细胞对照n n阳性对照阳性对照        检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性检测抗体特异性或确定实验方法的稳定性、准确性n n空白对照空白对照 确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功          n n补偿对照补偿对照      多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节多色荧光标记时，用于荧光光谱重叠的调节同型对照（同型对照（Isotype Control））n n用于消除由于抗体非特异用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的性结合到细胞表面的FcFc受受体而产生的背景染色体而产生的背景染色n n与染色的单克隆抗体与染色的单克隆抗体 ① ①相同种属来源相同种属来源 ② ②相同免疫球蛋白及亚型相同免疫球蛋白及亚型 ③ ③相同荧光素标记相同荧光素标记 ④ ④相同剂量和浓度相同剂量和浓度 ⑤ ⑤由未免疫动物血清纯化而来由未免疫动物血清纯化而来双色标记荧光补偿双色标记荧光补偿 口诀：横平竖直荧光补偿对照荧光补偿对照分析分析类类型型管管功能功能                                            加入的抗体加入的抗体单单色分析色分析1 1IsotypeIsotypeγ1-FITCγ1-FITC2 2Sample1,2……Sample1,2……A-FITCA-FITC双色分析双色分析1 1IsotypeIsotypeγ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PE2 2Compensation1Compensation1A-FITCA-FITCγ2a-PEγ2a-PE3 3Compensation2Compensation2γ1-FITCγ1-FITCB-PEB-PE4 4Sample1,2……Sample1,2……A-FITCA-FITCB-PEB-PE三色分析三色分析1 1IsotypeIsotypeγ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PEγ1-PC5γ1-PC52 2Compensation1Compensation1A-FITCA-FITCγ2a-PEγ2a-PEγ1- PC5γ1- PC53 3Compensation2Compensation2γ1-FITCγ1-FITCB-PEB-PEγ1- PC5γ1- PC54 4Compensation3Compensation3γ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PEC-PC5C-PC55 5Sample1,2……Sample1,2……A-FITCA-FITCB-PEB-PEC-PC5C-PC5四色分析四色分析1 1IsotypeIsotypeγ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PEγ1-ECDγ1-ECDγ1- PC5γ1- PC52 2Compensation1Compensation1A-FITCA-FITCγ2a-PEγ2a-PEγ1- ECDγ1- ECDγ1- PC5γ1- PC53 3Compensation2Compensation2γ1-FITCγ1-FITCB-PEB-PEγ1- ECDγ1- ECDγ1- PC5γ1- PC54 4Compensation3Compensation3γ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PEC- ECDC- ECDγ1- PC5γ1- PC55 5Compensation4Compensation4γ1-FITCγ1-FITCγ2a-PEγ2a-PEγ1- ECDγ1- ECDD-PC5D-PC56 6Sample1,2……Sample1,2……A-FITCA-FITCB-PEB-PEC-ECDC-ECDD-PC5D-PC5注意事项注意事项n n样本的采集、储存n n样本的染色n n全血样本的溶血效果n n流式实验对照的设置样本的采集样本的采集n手术切除的新鲜标本取材时，要避免出血或组织坏  死。

深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，造成检测结果的误差n采集静脉血样本时，要避免发生溶血n收集培养的细胞时，要注意选择消化的方法和试剂样本的储存样本的储存原则：时间越短越好n n肝素抗凝的外周血和骨髓：室温肝素抗凝的外周血和骨髓：室温 ≦72小时n nEDTAEDTA抗凝的标本：室温抗凝的标本：室温 ≦ 2424小时小时n nACDACD抗凝的外周血：室温抗凝的外周血：室温 ≦ 7272小时小时n nACDACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝n粒细胞、血小板功能检测：即刻检测n单核细胞表面抗原分析： ≦1小时，4℃n嗜酸性粒细胞表面抗原分析： ≦24小时，4℃n淋巴细胞免疫表型与DNA含量的分析： ≦72小时样本的染色样本的染色n n影响抗原抗体反应的因素    电解质、反应温度与时间电解质、反应温度与时间   、、PHPH值（值（7.27.2～～7.47.4））n n流式抗体的选择    根据流式细胞仪的类型选择抗体根据流式细胞仪的类型选择抗体          抗体应用级别、滴度和使用量的选择抗体应用级别、滴度和使用量的选择          根据抗原表达量选择抗体根据抗原表达量选择抗体 溶血，即裂解红细胞。

它是流式细胞术分析白细胞的先决条件溶血不好，白细胞群不能很好分开，溶血好坏直接影响检测结果因此，必须对溶血过程进行严格控制 全血样本：溶血效果很重要全血样本：溶血效果很重要影响溶血的因素：影响溶血的因素：采血过程采血过程                                                                溶血剂的使用溶血剂的使用                                                                实验操作过程实验操作过程结语结语n流式细胞术的样本制备没有一个黄金标准n最佳样本制备方法需要根据具体情况独立设定评估常用的荧光染料常用的荧光染料     荧光染料荧光染料        激发波长激发波长   (nm) (nm)      发射波长发射波长(nm)     (nm)     用途用途                  颜色颜色          FITCFITC                          488  488                    525                                  525              免疫荧光免疫荧光            绿色绿色          PE(RD1PE(RD1)       )        488 488                    575                                  575              免疫荧光免疫荧光            橙色橙色               ECDECD                            488  488                    620                                  620              免疫荧光免疫荧光            橙红橙红          PeCy5PeCy5                        488  488                    675                                  675              免疫荧光免疫荧光              红红          PIPI                                     488 488                    620               DNA                    620               DNA染色染色          橙红橙红          PECy7PECy7      488   488          755   755                          免疫荧光免疫荧光            深红深红          PerCPPerCP      488   488          670  670                            免疫荧光免疫荧光          深红深红参考书籍参考书籍n n《实用流式细胞术彩色图谱》王书奎主编   n n《流式细胞术基本原理与实用技术》梁智辉主编n n《临床流式细胞分析》 王建中主编n n《流式细胞术》 杜立颖主编实验：人外周血实验：人外周血T淋巴细胞亚群的淋巴细胞亚群的 检测与分析检测与分析淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞粒细胞粒细胞这三群细胞分别由具有不同功能的细胞组成这些细胞数量不等，甚至非常稀少这些细胞表达不同的标记物，是用来区分它们的基础T T T T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)(CD3+)(CD3+)(CD3+)名名名名 称称称称功功功功 能能能能CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD4+辅助性辅助性/ /诱导性诱导性T T细胞细胞( (ThTh/Ti)/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫辅助和诱导细胞免疫和体液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29- CD3+CD4+CD29-辅助性辅助性T T细胞细胞( (ThTh) )诱导性诱导性T T细胞细胞(Ti)(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+CD3+CD8+CD3+CD8+CD3+CD8+抑制性抑制性/ /杀伤性杀伤性T T细胞细胞(Ts/(Ts/TcTc) )抑制免疫反应抑制免疫反应/ /杀伤异源细胞杀伤异源细胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29- CD3+CD4+CD29-抑制性抑制性T T细胞细胞(Ts)(Ts)杀伤性杀伤性T T细胞细胞( (TcTc) )抑制细胞和体液免疫抑制细胞和体液免疫细胞毒性细胞毒性T T细胞细胞CD3+CD4+CD8+CD3+CD4+CD8+活化的活化的T T细胞细胞在在T T细胞恶性增生时升高细胞恶性增生时升高 CD3+CD4-CD8- CD3+CD4-CD8- 有调节功能的有调节功能的T T细胞细胞, ,其表达其表达  / /  T T细胞受体细胞受体(TCR (TCR  / /  ) ) CD4+/CD8+CD4+/CD8+CD4+/CD8+CD4+/CD8+比值比值比值比值CD45RA+CD45RO- CD45RA+CD45RO- 幼稚的幼稚的/ /静止的静止的T T淋巴细胞淋巴细胞 当免疫系统没有能力更新辅助性或抑当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性制性/ /细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低细胞亚群较低 CD45RA-CD45RO+ CD45RA-CD45RO+ 记忆性记忆性T T淋巴细胞淋巴细胞 病病菌菌感感染染时时升升高高, , 但但在在慢慢性性病病毒毒感感染染, , 如如HIVHIV患者中降低患者中降低CD45RA+CD45RO+ CD45RA+CD45RO+ 活化的活化的T T细胞细胞, , 感染时升高感染时升高 感染时升高感染时升高活化活化活化活化T T T T淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞名名名名 称称称称功功功功 能能能能CD3+HLA-DR+CD3+HLA-DR+活化活化T T细胞细胞CD4+HLA-DR+ CD4+HLA-DR+ 活化的辅助性活化的辅助性/ /诱导性诱导性T T细胞细胞CD8+HLA-DR+CD8+HLA-DR+活化的抑制性活化的抑制性/ /杀伤性杀伤性T T细胞细胞CD4+CD25+ CD4+CD25+ 活化的辅助性活化的辅助性/ /诱导性诱导性T T细胞细胞CD8+ CD25+ CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性活化的抑制性/ /杀伤性杀伤性T T细胞细胞在在病病毒毒感感染染的的患患者者中中增增加加; ; 其其增增加加意意味味着着HIVHIV患者的预后较差患者的预后较差B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(19+)(19+)(19+)(19+)CD19+CD23+ CD19+CD23+ 活化的活化的B B细胞细胞过敏患者中升高过敏患者中升高 CD19+CD5+ CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ CD19+CD5+CD23+ 慢性慢性B B细胞白血病及单克隆细胞白血病及单克隆B B淋巴细胞淋巴细胞 NKNKNKNK细胞细胞细胞细胞CD3-CD(16+56)+CD3-CD(16+56)+自自身身免免疫疫性性疾疾病病时时降降低低, , 而而病病毒毒感感染染时时升升高高 CD3+CD57+CD3+CD57+CMV(CMV(巨细胞病毒巨细胞病毒) )感染的强烈征兆感染的强烈征兆 1.取新鲜抗凝血100ul，置于FCM测量管中；2.直接标记法：加入带荧光标记抗人的单克隆抗体 10ul，充分混匀，4℃闭光孵育20～30min; 3.加入溶血剂A液600ul, 轻轻振荡15s, 加入溶血剂B液260ul, 轻轻振荡15s， 加入溶血剂C液100ul, 振荡10s,上机检测。

ACK溶血剂:加入2mlACK溶血剂，充分混匀，反应5min, 1000r/min离心5min，去上清；重复一遍，用PBS洗涤1遍，收集细胞上机检测实验步骤实验步骤ABC溶血剂配方溶血剂配方n nA: 0.12%甲酸    (超纯水配置)n nB:碳酸钠 6.0g/L ; 氯化钠14.5 g/L ;       硫酸钠 31.3g/L   (超纯水配置)n nC:多聚甲醛  10.0g/L( PBS配置)                                   ACK溶血剂配方溶血剂配方n n150mM(8.025g)                       NH4Cl      n n10mM  (1.01g)                        KHCO3n n0.1mM  (0.0372g)                   Na2EDTAn n调PH至7.2-7.4，定容至1000mln n无菌滤膜滤过，4℃保存 实验分组实验分组n nA:同型对照管或空白对照(调节电压)n nB: 单标补偿管(电压不变,调节荧光补偿)n nC: 双标样本检测管荧光补偿荧光补偿““A门门””内内CD3/CD4的表达的表达““A门门””位置变化引起的改变位置变化引起的改变““A门门””位置变化引起的改变位置变化引起的改变小鼠脾细胞小鼠脾细胞CD3+/CD4+的表达的表达思考题、实验报告思考题、实验报告1、同型对照、空白对照、补偿对照各有什么  意义？2、多色荧光标记时如何设置对照？3、样本处理过程中要注意哪些事项。

实验报告：请根据你科研的需要设计一个完整的流式实验内容包括：实验原理、材料与方法、实验步骤、实验结果等Thank you！。