分子排阻色谱法标准操作规程(新).doc

分子排阻色谱法标准操作规程共2页第1页文件编号：09—C—083—03替代号：09—C—083—02变更内容：2010年版《中国药典》的执 行，标准发生变更起草人：日期： 年 月曰审核人：日期： 年 月曰批准人：日期： 年 月曰颁发部门：印制份数：生效日期： 年 月 日分发至：总经理（） 生产副总经理（） 质量副总经理（）行政副总经理（） 行政部（） 生产部（） 设备动力维修车间（）质管部（） 物资储备科（）1目的：建立分子排阻色谱法标标准操作规程，使操作规范、准确2范围：适用于药品蛋白质多肽的分子量测定3职责：质检员按此规程进行操作4引用标准：《中国药典》2010年版5工作原理：分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一 种液相色谱技术分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制 色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex）和聚 丙烯酰胺凝胶（Sepharose）等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸文件编号：09—C—083—03 共2页第2页的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相 应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程 中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有 孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长， 表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。

6.测定法6. 1分子量测定法一般适用于蛋白质多肽的分子量测定按各品种项下规定的方法，选 用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有 规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(S DS)处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于 一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lg Mw=a+btR,供试品以保留时•间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的 分子量6.2生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法生物大分子聚合物如多糖、多聚核甘酸和胶原蛋白等具有分子大小不 均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的 关键指标在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试 品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和 适宜的GPC软件，以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程IgMw-a+btR,供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。

RTi / Z (RTi / Mi)Mw= L (RIiMi) / ERLD=Mw/Mno式中Mn为数均分子量；Mw为重均分子量；D为分布系数；R L i为供试品在保留时"间i时的峰高；舰为供试品在保留时间i时的分子量6. 3高分子杂质测定法高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药 物在生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能 产生过敏反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离6. 4定量方法6.4. 1①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定一般用于高分子杂质含量较低的品种6.4.2面积归一化法同高效液相色谱法项下规定6.4. 3限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时 间的组分，一般用于混合物中高分子物6.4.4自身对照外标法一般用于SephadexG-IO凝胶色谱系统中B内酰 胺抗生素中高分子杂质的检查在该分离系统中，除部分寡聚物外，P内 酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表 现为单一的色谱峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分 子杂质的相对百分含量6. 5 SephadexG-TO的处理方法色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sepha一dexG-10用水浸泡 48小时，使之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人玻璃柱，一次性装填 完毕，以免分层，然后用水将附着玻璃管壁的SephadexG-1。

洗下，使色谱 柱面平整，新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4〜6小时，以排出柱中的气 泡供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将供试品加在床 的表面（此时，先将床表面的流动相吸干或渗干，立即将供试品溶液沿着 色谱管壁转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入 固定和后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3〜5m 1流动相，以洗下残留在色 谱管壁的供试品溶液）7 .对仪器的一般要求分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一 般分常压、中压和高压在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定 中，通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC）应选用与供试品分子大小相 适应的色谱柱填充剂使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值 不宜超出填充剂的耐受力，一般pH值在2〜8范围流动相中可加入适量 的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%,流速不宜过快，一般每分 钟为0. 5〜1. Omlo8系统适用性试验高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数（n）、分 离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时•，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：R二二聚体的峰高/单体与二聚体之间的谷高除另有规定外，分离度应大于2.0。