cpg-odn不同给药途径对哮喘小鼠炎症反应影响及其机制探讨.pdf

——本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得广东医学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料作者签名：隘丝堇日期：趁z z ：亟：丝I学位论文知识产权声明本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产权归属学校本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为广东医学院学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利注：保密的学位论文在解密后适用本声明作者签名：足筮必．日期：．础：么：丝’l 导师签名：羔／1 —1 江日期：‘丝堕L 上- 乡t 卜o’- _ _ _ _ _ _ ·- _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ·_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ - ．．．．．．．．- 一目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41 前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71月U 吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。

⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·71 ．1 研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71 ．2 研究目的⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．n1 ．3 研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 12 材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 22 ．1 材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 22 ．2 方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 32 ．3 统计学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 83 结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 94 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 85 小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 4参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 5文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 9综述参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4 6致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 9附录一缩写词中英文对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 0附录二在读硕士期间的科研情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 1T a b l eo fC o n t e n t sA b s t r a c ti nC h i n e s e ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1A b s t r a c ti nE n g l i s h ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41I n t r o d u c t i o n ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71 ．1B a c k g r o u n d ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71 ．2O b j e c t i v e ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 11 ．3C o n t e n t s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 12 M a t e r i a l sa n dM e t h o d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．】【：12 ．1M a t e r i a l s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．1 22 ．2M e t h o d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 32 ．3S t a t i s t i c a lM e t h o d s ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 83R e s u l t s ．．．⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．194D i s c u s s i o n ．．．．⋯．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．⋯．．．．．．．．⋯．．．．．．⋯．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 85S u m m a r y ．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．3 4R e f e r e n c e s ⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．3 5R e v i e w ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．⋯．．．．．．．．．．3 9R e f e r e n c e so fr e v i e w ．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．4 6A c k n o w l e d g m e n t s ⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．4 9A p p e n d i x1A b b r e v i a t i o n ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．······5 0A p p e n d i x2S c i e n c er e s e a r c hi np o s t g r a d u a t e ⋯⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．·······．5 1中文摘要【目的】本实验研究C p G 不同给药途径对哮喘小鼠肺泡灌洗液及外周血I F N 吖、I L - 4细胞因子及气道组织病理改变的影响，同时检测N F ．r d 3 在肺组织内的表达情况，探讨C p G 治疗哮喘的机制及其安全性。

方法】4 0 只B A L B ／c 小鼠随机分5 组：A 组为正常对照组，以P B S 致敏激发；B组为哮喘组，以O V A 致敏激发；C 组为地塞米松组，O V A 致敏激发并于激发前腹腔内注射地塞米松；D 组为C p G 腹腔注射组，O V A 致敏激发并腹腔注射C p G ；E 组为C p G 滴鼻组，O V A 致敏激发并鼻腔滴入C p G 最后1 次激发后2 4 h 内处死动物并收集标本计数肺泡灌洗液( B r o n c h o a l v e o l a rL a v a g eF l u i d ，B A L F ) O P 的白细胞总数及嗜酸性粒细胞( E o s i n o p h i l ，E O S ) 数；用酶联免疫吸附试验( E n z y m e ．L i n k e dI m m u n o s o r b e n tA s s a y , E L I S A ) 检测B A L F 和血清中白细胞介素- 4 ( I n t e r l e u k i n 一4 ，I L ．4 ) 及干扰素吖( I n t e r f e r o ng a m m a ，I F N - 丫) 肺组织病理标本行苏木素．伊竺工( H e m a t o x y l i n ．E o s i n e ，H E ) 染色观察小鼠肺组织病理形态学改变，用免疫组织化学( I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，I H ) 法检测小鼠肺组织中N F ．v , B 表达水平。

所得数据均用统计学软件S P S S l 3 ．0 进行统计分析结果】1 小鼠反应性观察对照组小鼠无明显呼吸急促表现，行动活泼哮喘组经O V A 激发后出现呼吸急促，烦躁不安，连续激发三天后，皮毛粗糙，活动能力下降地塞米松组及腹腔注射C p G 组症状较哮喘组轻C p G 滴鼻组较哮喘组出现更加明显的呼吸短促，皮毛粗糙，活动能力严重下降，对刺激反应迟钝，进食量少等表现2 小鼠B A L F 中细胞学改变哮喘组B A L F 中白细胞总数及E o s 计数均较正常对照组有明显增加( 尸 9 5 “ C ) ，然后放入切片，加盖高压锅加温至喷气( 限压阀升起) 后约2 分钟，置流水下降压，待高压锅小阀门下降后打开盖子，自然冷却至室温④蒸馏水泡洗3 分钟×3 次⑤用免疫组化笔将玻片上贴有组织的位置圈出，P B S 缓冲液冲洗3 分钟X2 , - - , 3 次⑥去离子水( 过氧化氢甲醇) 1 0 分钟×1 次，用于封闭内源性过氧化物酶，减少背景⑦P S B 液冲洗3 分钟X3 次⑧滴加一抗，室温下1 小时( 最长不超过2 小时) ，4 ℃则要过夜，但不超过2 4 小时⑨P B S 液冲洗3 分钟X3 次。

⑩滴N - - - 抗，室温下反应1 0 ～1 5 分钟1 1 使用蒸馏水配制D A B 显色液( D A B 显色液有毒性，需戴手套) 滴加至标本，待肉眼可见黄染即迅速放入自来水中冲洗，洗净显色剂1 2 略作冲洗后放入苏木素( 加入催化剂) 3 ～5 秒种，放入自来水1 3 酒精梯度7 5 ％、8 5 ％、9 5 ％、1 0 0 ％各3 秒脱水1 45 6 0 C 烤箱3 0 分钟1 5 二甲苯透明数秒，自然风干1 6 树胶封片结果判读：阳性表达细胞主要在胞核中呈现棕黄色、黄色，胞浆中亦可有表达，但为未激活的N F ．1 ( B 每个标本选取3 个高倍镜视野( X 4 0 0 倍) ，计数视野内细胞核N F ．出阳性表达数及细胞总数，计算出阳性表达比例，结果取平均值2 ．3 统计学方法使用S P S S l 3 ．0 统计软件进行统计分析所得数据用又4 - s 表示多组样本均数比较采用单因素方差分析，先行方差齐性检验，方差齐时各组间两两比较采用q 检验进行，方差不齐时各组间两两比较采用T a m h a n e s ’s T 2 检验，P < 0 ．0 5 表示差异有统计学差异1 83 结果3 ．1 小鼠哮喘模型的建立小鼠经O V A 致敏并激发后表现为呼吸急促、烦躁不安、大小便失禁、点头样喘息及皮毛色泽改变。

病理切片显示，气道粘膜水肿，上皮细胞脱落，肺组织出现大量嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润，符合哮喘的病理改变，说明哮喘模型制备成功3 ．2 各组小鼠症状观察对照组小鼠实验过程无明显呼吸急促表现，行动活泼，进食正常，皮毛光滑哮喘组经O V A 激发后出现呼吸急促，点头呼吸，烦躁不安，连续激发三天后，皮毛粗糙，活动能力下降地塞米松组及腹腔注射C p G 组症状较哮喘组轻C p G滴鼻组出现呼吸短促，皮毛粗糙明显，活动能力严重下降，对刺激反应迟钝，进食鼍少等表现 图1 )图1 各组小鼠症状观察左起：C p G 滴鼻组，C p 6 腹腔注射组，地塞米松组，哮喘组，正常对照组1 93 ．3 各组小鼠B A L F 中细胞总数、E o s 计数的比较实验结果显示：哮喘组B A L F 中白细胞总数及E o s 计数结果均较正常对照组有明显增高( 尸< 0 ．0 5 ) 。