40507042-开题报告.doc

陕西师范大学化学与材料科学学院化学专业2009届本科生毕业论文（设计）开题报告姓名刘莉学号40507042论文（设计）题n基因重组Lactobacillus plantarum a・L■鼠李糖昔酶的 活性分析和序列分析选题的意义：我国的柑橘资源丰富，开展柑橘加工和综合利用很有必要，但柑橘加工过程会出现明显 苦味，着限制了在食品工业中的广泛应用，消除柑橘汁的苦味就显得非常必要目前主要的 脱苦方法有酶法、吸附法、屏蔽法、超临界流体萃取脱苦、代谢脱苦等，酶法脱苦具有专一 性，对果汁风味和营养成份无影响，是最理想的方法•柚背酶因可以水解柑橘中的主要苦味物 质柚皮昔而日益受到重视.由于糖背酚的底物适应性很强，且可以利用非活化的糖作为糖基供体，被广泛应用于 各类糖类化合物的合成糖背酶不仅可以催化形成寡糖，也可以将直链或芳香的醇糖基化， 还可以催化多肽、菇类、酚类、生物碱以及抗生素等物质的糖基化a壬鼠李糖昔酶广泛分布于自然界、动物组织、植物、真菌、细菌中a・L■鼠李糖昔 酶可以水解包含鼠李糖基的糖和多糖许多工业已经开始利用鼠李糖昔酶利用鼠李糖昔酶水解柚皮昔来消除柚子 汁的苦味，处理后苦味仪为原来的二分之一。

L■鼠李糖背酶通过水解橘皮背和胶质也用来 澄清橘子汁，而且还能够改善酒的口感与香味目前，国际上大多从分子水平研究糖背酶，如确认糖昔酶基因，操纵子和启动子序列 等在实际工业生产中，糖昔酚被广泛冏用于医药品和食品工业限制糖昔酶应用的主要问 题在于微生物的产酶活力低、产物提取分离与纯化困难，而使得糖背酶的生产成本高、产塑 低目前我国工业化糖昔酶产品品种少、价格高，有些品种如卩■咲喃糖昔酶还没有工业化 产品，其应用完全依赖国外进口，如果能有效地解决这些问题，不仅对糖昔酶的研究有促 进作用，也对酶法生产糖昔类化合物等相关产品产生重大影响研究综述（前人的研究现状及进展情况）：酶法脱苦用于柑桔果汁脱苦的酚按作用对象可分为黄烷酮糖昔类化合物脱苦酚和柠檬 苦素类化合物脱苦酶作用于黄烷酮糖昔类化合物的脱苦酶和脱苦机理:这类酚主要是柚皮 背酚,它是由a・L・鼠李糖昔酌和卩・D■葡萄糖昔酶组成鼠李糖昔酶可将柚皮昔水解成樱 桃昔和鼠李糖,樱桃昔的苦味约为柚皮昔的1心,因此苦味有所减轻樱桃昔可在P-D ■葡萄糖昔酶的继续作用下生成无苦味的柚皮素和葡萄糖2001年Chien等用高效液相色谱法证 实这一水解顺序,并指出仅有卩葡萄糖昔酶存在时,柚皮昔不能被水解。

固定化酶有柠檬苦索类脱苦嗨,其最适pH值都偏向碱性，如果直接固定化酶用于脱苦， 必须先调节柑桔汁的pH值，这就会使柑桔汁的品质变劣而柚皮昔酶则不同,其最适pH值 与柑桔汁的自然pH相接近因此,在用固定化酶对柑桔汁其行脱苦时使用最多的是柚皮讦 酶1998年Soares将酚固定在醋酸纤维上其实验结果都表明，用固定化酚处理后的果汁 苦味明显降低在生产中所使用的柑皮昔酗是山-L■鼠李糖昔酚和卩葡萄糖昔酚组成的混合酌制剂, 这就有可能因为某一种酌活动的下降或丧失而造成整个酶制剂活力的下降或丧失据研 究,a・L ■鼠李糖昔酶和卩・D ■荊萄糖昔酶对底物的水解速度并不相同，前者比厉者具有更高的 水解速度因此，若能将2种酶加以分离分别使用,将会更经济更有效的使用酚制剂和便于工 业化生产2000年，Lvorlov等人将编码（x・L・鼠李糖昔酶的基因进行克隆并导入埃希氏大肠 杆菌中，该基因在埃希氏大肠杆菌中成功的进行了表达糖昔酶在媒糖合成、烷基糖昔和芳香基糖昔的合成、氨基酸和多肽的糖基化以及抗生索 的糖基化方面发挥了重要作用目前，国际上大多从分子水平研究糖昔酚，如确认糖昔酶基 因，操纵子和启动子序列等在实际工业生产中，糖昔酶被广泛应用于医药品和食品工业。

限制糖讦酌应用的主要问题在于微生物的产酚活力低、产物提取分离与纯化困难,从而使得 糖昔酣的生产成本高、产量低目前我国工业化糖昔酶产品品种少、价格高，有些品种如卩■咲喃糖昔酗还没有工业化 产品，其应用完全依赖国外进口，如果能有效地解决这些问题，不仅对糖昔酶的研究有促 进作用，也对酣法生产糖昔类化合物等相关产品产生重大影响论文（设计）写作提纲（除题戸外，具体到三级标题）中文摘更 中文关键词 英文摘要 英文关键词 1引言1.1糖昔酣的概述1」」糖昔酚的分类及性质1.1.2糖昔酶的催化机制1.1.3糖昔酶的应用1.2 a・L■鼠李糖讦酣121 a -L-鼠李糖昔酶的催化机制1.2.2次鼠李糖背酶研究进展1.3本文的研究目标和思路2研究部分2.1试剂、材料和仪器2.2试剂的配制2.2.1 50mM pNPR 的配制2.2.2 0.1 M重金属离子溶液的配制2.2.3 500mM的葡萄糖溶液的配制2.3 a・L ■鼠李糖背酚活性的测定原理2.4 a・L■鼠李糖昔酣活性的测定241参比溶液中酯活性的测定2.4.2重金属离子对a・L■鼠李糖昔酚活性的影响2.4.3乙醇对a・L■鼠李糖昔酶活性的影响2.4.4果汁中葡萄糖a・L■鼠李糖昔酌活性的影响2.4.5 EDTA对a・L■鼠李糖昔酶活性的影响2.5 a・L■鼠李糖昔酶的序列分析3结果与讨论3.1酚活性测试结果与分析3」」重金属离子对a・L■鼠李糖昔酌活性的影响3.1.2乙醇对（x・L■鼠李糖昔酶活性的影响3.1.3葡萄糖对a・L■鼠李糖昔酚活性的影响3.1.4 EDTA对a・L■鼠李糖昔酶活性的影响3.2 a・L■鼠李糖讦酌的序列分析3.3总结4结束语5参考文献6致谢特色与创新之处：1. a・L-鼠李糖昔酶是来源于Lactobacillus plantarum的重组酸。

2. 研究*L・鼠李糖昔酚的活性影响因素,更好的发挥-L■鼠李糖昔酶的催化活性，促进a・L・鼠李糖苻酶在消除柑橘类果汁的苦味，提高该类饮料的品质，生产功能化食品中的应用拟采用的研究方法和技术路线:研究重金属离子(Zn2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+).乙醉、葡萄糖、EDTA对鼠李糖昔酶活 性的影响本实验中所用的oc・L■鼠李糖昔酶的最适温度为37t,最适酸碱度为&0将酶溶 液加入含有不同抑制剂的PBS溶液(pH=8.0)中，然后加入底物(pNPR)引发反应在可控 温的紫外可见分光光度仪上，检测其反应动力学曲线通过与参比溶液中酶活性的比较，可 以测出酶活性受到的影响利用ClustalW对Lactobacillus plantarum a・L-鼠李糖昔酶的蛋白 质序列进行比对，分析它与同族其他酚的同一性和相似性，及其保守序列研究工作进度安排：2009.2.26确定论文题目2009.2.27-3.08查阅有关酚的性质及活性的文献，提出实验思路2009.3.09-3.15根据文献确定实验初案2009.3.16-3.31进实验室学习掌握各种相关仪器的操作2009.4.01-4.12查阅相关文献，确定基因重组oc・L■鼠李糖昔酚活性分析、序列分析和二维 结构模拟的实验方案2009.4.13-4.29根据实验方案，研究重金属离子、乙醇、葡萄糖对汶丄■鼠李糖昔酶活性的 影响2009.4.30-5.25根据实验方案，对重组汶丄■鼠李糖昔酚的蛋口质序列进行序列分析和比对2009.5.25-6.03根据实验过程与结果，撰写毕业论文2009.6.13毕业论文答辩主要参考文献FI录：[1]张晨，刘志伟•柑橘类果汁的脱苦•江苏食品与发酵，200Q (1)： 2fr-28⑵郁惠蕾，许建，林国强.糖昔水解酚在糖昔合成中的应用概况.有机化学, 2006, 26 : 1052-1058[3] Jang I, Kim D. Purification and characterization of alpha-L-rhamnosidase from Bacteroides JY-6. a human intestinal bacterium.Biol Pharm Bull, 1996,19:1546-1549[4] Yadav S, Yadav K. Secretion of alpha-1 ・rhamnosidasc by Aspcrgillustcrrcus and its role in debittering of orange juice. Sei Tnd Res, 2000,59:1032-1037[5] Chien P, Sheu F, Shyu Y. Monitoring enzymatic debittering in grapefruit juice by high performance liquid chromatography. Food Dmg Anal, 2001,9:115-120[6] Spagna G, Barbagallo RN, Martino A, Pifferi PG. A simple method for purifying glycosidases: alpha-l-rhamnopyranosidase from Aspergillus niger to increase the aroma of Moscato wine. Enzyme Microbial Tcchnol, 2000,27:522-530[7] Gallego M, Pinaga F, Ramon D, Valles S. Purification and characterization of analpha-l-rhamnosidase from Aspergillus terreus of interest in winemaking・ Food Sci, 2001,66:204-209[8] Orejas M, Ibanez E, Ramon D. The filamentous fungus Aspergillus nidulans produces an alpha-l-rhamnosidasc of potential oenological interest. Lett Appl Microbiol, 1999,2&383-388[9] Henrissat B・ A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem, 1991 ,280(pt2):309[10] Henrissat B, Bairoch A. Updating the sequencebased classification of glycosyl hydrolases. B -iochem J, 1996,316[11] Davies G, Henrissat B. Stmcturcs and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 1995,3 (9):853[12] Henrissat B, Callebaut I, Fabrega S , et al. Con served catalytic machinery and the prediction of a common fold fbr several families of glycosyl hydrolases. Proc N at Acad Sci USA, 1995,92 (15):7090[13] Henrissat B , Davies G. Structural and scqucnccbas。