天然产物分析实验报告报告.docx

天然产物活性成分检测实验报告姓名：李雪怡学号：2012332870009年级班级：12生物制药（1）班实验一：茶叶中茶多酚的粗提取与含量测定一、 实验目的：1、 了解并熟悉茶多酚的元素组成、结构构成、理化性质2、 掌握溶剂萃取法粗提取茶多酚的原理与操作3、 掌握酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量的原理及操作4、 了解分光光度计的使用方法和注意事项二、 实验原理和应用：茶多酚(Tea Polyphenols)是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄 酮类、黄酮醇类和酚酸类等其中以黄烷醇类物质(儿茶素)最为重要茶多酚又称茶鞣 或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一研 究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可 使锶90和钻60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”目前国内外茶多酚粗品的提取的方法主要有：溶剂萃取法、离子沉淀法、树脂吸附分离 法、超临界流体萃取法、超声波浸提方法、微波浸提法等等在这些提取茶多酚的方法中， 每种方法都有它各自的针对性和使用范围，使用时要根据各自的情况而定根据实验室的 条件及实验要求，本实验采用溶剂萃取法对干茶叶中的茶多酚进行粗提取，即利用茶多酚易 溶于乙酸乙酯等有机溶剂的原理进行液-液萃取。

茶多酚的测定方法有高锰酸钾直接滴定法和酒石酸铁比色法，由于高锰酸钾直接滴定法 操作比较复杂，且靠肉眼观察颜色判断终点，如果样品溶液颜色较深时，可能影响测定结果 本实验将应用酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量酒石酸铁能与茶多酚生成紫褐色络合物, 络合物溶液颜色的深浅与茶多酚的含量成正比因此可以用比色方法测定该法可避免高锰 酸钾滴定法所产生的人为视觉误差三、 实验仪器、材料和试剂实验仪器：分光光度计、干燥箱、电子天平、pH计、真空泵、纱布、漏斗、旋转蒸发仪、250ml容量 瓶、50ml容量瓶、分液漏斗实验材料：干茶叶(市售散装茶即可)实验试剂：硫酸亚铁(FeSO4・7H2O)，酒石酸钾钠(KNaC4H4O6・4H2O)，磷酸氢二钠 (Na2HPO4・ 12H2O)，磷酸二氢钠(NaH2PO4・ 2H2O)，乙酸乙酯四、实验操作1、溶液的配制酒石酸亚铁溶液制备：称取0.25 g （准确至0.0001）硫酸亚铁，1.25 g酒石酸钾钠（准 确至0.0001），用水溶解并定容至250 ml （低温保存，有效期10天）2、 干茶叶的预处理将干茶叶洗净、晾干，烘干，最后粉碎粉碎的目的是与液体的接触面增大使提取率增 高。

由于试验条件的限制，用剪刀代替粉碎机将干茶叶剪碎，并且用研钵研细，干茶叶量为 50.00g3、 茶多酚的粗提取与定性检测称取经过预处理的干茶叶末30. 00g，加入250mL 90°C接近沸水中搅拌浸提、过滤，先 后用250mL的乙酸乙酯萃取两次合并两次有机相减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得黄色粉 末状茶多酚从外观上看，为黄色粉末状物理性能为，易溶于水及乙醇，味苦涩图1高浓度茶多酚样品（98%）4、茶多酚溶液的配置与含量的测定称取步骤3中提取的茶多酚粉末0.2500g，加水溶解定容至250mL，混匀，即为每毫 升含1mg步骤3中提取的茶多酚粉末的溶液分别取茶多酚溶液1. 0mL、2. 0mL、3. 0mL、4. 0mL于4个50mL容量瓶中，各加水 至10mL，再加酒石酸亚铁溶液10mL，加入pH为7. 5的磷酸缓冲液至刻度，混匀后用1cm 比色皿，以空白试剂作参比，于波长540nm处测定吸光度A,计算实验数据，并绘制实验 数据表格x100%V x mA x 3.913x1000cd —茶多酚的含量（％）, A—样品溶液的吸光度值，T—样品溶液的总体积（mL） V—测定用样品溶液的量（mL）, m—样品质量（g）3.913—用1cm比色杯，当吸光度为1.0时，试液中茶多酚的浓度为3.913（mg/mL） 表1实验数据汇总实验次数AT (mL)V (mL)m (g)® (%)®(mg/g)10.10425010.250040.7026.6120.22325020.250043.6338.5430.36225030.250047.2247.2240.46325040.250045.2945.295、实验结果检验——绘制茶多酚标准曲线根据步骤4中所得的实验数据，绘制茶多酚标准曲线，斜率R处于0.95-1.05之间方可达到 实验要求。

表2绘制标准曲线所需数据V(mL)1.02.03.04.0A0.1040.2230.3630.463e (mg/g)40.7043.6347.2245.29图2茶多酚标准曲线（例）茶多酚标准曲线T—I 至引h—羲性（系列1）—线性（系列1）8 6 4 24 4 4 4试验中，第四组偏差较大舍去得到R2介于0.95〜1.05，符合要求五、 注意事项1、 磷酸盐缓冲液在常温下容易生长霉菌，放冰箱中保存或临用时现配2、 茶多酚溶液应保持澄清，若溶解后溶液浑浊应先过滤3、 实验前需仔细阅读分光光度计使用说明书及注意事项4、 若茶多酚标准曲线斜率R不介于0.95-1.05之间，则实验数据无效六、 实验结果与分析本次实验，所采用的测定方法主要为酒石酸亚铁比色法茶叶中多酚类物质能与亚铁离 子形成紫蓝色络合物，用分光光度法测定其含量利用比色法进行测定，可以有效地避免由 视觉产生的误差，加以检验后可以得到较为准确的数据但经实验证明，酒石酸亚铁比色法测定的茶多酚含量明显偏高下表为杭州茶叶研究院 用两种比色法测定茶叶中茶多酚含量的实验结果表3两种测定方法实验结果的比较名称干物率茶多酚含量（％）Folin试剂比色法酒石酸亚铁比色法龙井95.218.933.3碧螺春92.920.626.9特级滇红90.212.416.8冻顶乌龙96.914.419.8铁观音95.614.121.0普洱熟饼90.36.18.8造成以上差异的原因有以下三点：第一，酒石酸亚铁比色法测得的是茶叶中多酚类物质 的总含量，是亚铁离子与多酚类物质络合形成蓝紫色物质，在540nm处有最大吸收。

而Folin 比色法测得的结果是茶叶中酚羟基被高价钨氧化后形成蓝色物质在765nm处有最大吸收 第二，酒石酸亚铁比色法在提取时采用沸水提取，而Folin比色法采用70%甲醇提取第三， 酒石酸亚铁比色法采用经验系数测算茶多酚的含量，而Folin比色法通过标准曲线换算茶多 酚的含量因此，可以得出Folin比色法在测定茶多酚含量的实验中测算更为准确 实验分析1. 不能用每次取等量的V(mL)所得结果求平均值的方法计算茶多酚的含量，每次取等量V会 有偶然性和不可控的操作失误对实验的结果影响较大相对而言等量递加做出线性曲线的话 结果的误差要小一些2•酒石酸亚铁相比于其它亚铁离子化合物而言，具有快速，简便，重现性好，但结果往往偏 高，真实性较低酒石酸亚铁络合物相对较稳定，也不易被氧化，酒石酸的酸性比较小，比 醋酸小，所以废液处理起来比较方便3.茶叶研磨要充分，可以提高茶多酚的溶出速度4•分液漏斗装置需检验气密性后才可使用，若气密性不好，可以涂黄凡士林5. 用乙酸乙酯萃取的时候，要进行放气操作，放气不能对着人也不能对着火源6. 加入酒石酸亚铁溶液后，容量瓶中溶液变色，由无色变为紫红色，说明发生了络合反应， 形成络合物显色。

实验二：茶叶中黄酮类化合物的提取和测定一、 实验目的：1、 了解黄酮类化合物对人体的药理和保健作用2、 掌握茶叶中提取黄酮类化合物的方法3、 掌握测定黄酮类化合物含量的方法二、 实验原理和应用：黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结而 成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、 甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团芦丁是黄酮类化合物之一，且对于紫外光具有极强的吸 收作用天然黄酮类化合物多以苷类形式存在，一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂 中；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中实验首先用紫外分光光度法，利用芦丁溶液在波长510nm处具有最大吸收的特点，测 定标准芦丁溶液的吸光值，绘制标准曲线用无水乙醇提取茶叶中的黄酮类化合物，得到茶 叶提取液取一定量的茶叶提取液，用紫外分光光度法测定吸光度，根据标准曲线测定提取 液中总黄酮的含量绝大多数的植物中都含有黄酮类化合物，掌握对茶叶中黄酮类化合物的提取和测定方 法，有利于对茶叶资源的综合利用对茶叶中黄酮类物质的提取、测定和纯化除以上方法外， 还有其他几种常用方法：1） 大孔树脂吸附法因为茶叶黄酮具有糖苷链和多酚结构，有一定的亲水性和极性，利 于弱极性和极性树脂对其吸附。

而非极性树脂吸附黄酮的量偏小2） 微波提取法微波具有试剂用量少、加热均匀、提取批量大、选择性好等优点以微 波辐射的方式可加快反应速度在提取黄酮类化合物上取得很好的效果3） 超声波辅助提取法是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介 质分子的运动速度、增大介质的穿透力来提取生物有效成分近年来越来越受到广泛重视 超声波提取具有节时、节能、节料、提取率高的特点三、 实验仪器、材料和试剂仪器：分光光度计，电子天平，恒温水浴锅，真空泵，布氏漏斗，250ml容量瓶，试管 材料：茶叶粉末试剂：无水乙醇，芦丁标准品，亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝试剂（以上均为分析纯）四、 实验操作1）绘制标准曲线总黄酮含量测定采用A1（NO3）3—NaNO2分光光度方法，黄酮与铝离子在碱性条件下与 亚硝酸钠形成黄酮的铝络合物，生成稳定的黄色黄色的深浅与黄酮含量呈一定的比例关系， 可与芦丁标准品作对照，于510 nm波长处比色定量测定本实验中茶叶总黄酮含量测定的标准品为芦丁准确称取于115烘干至恒重的芦丁 25 mg,用70%的乙醇溶解并定容至250 mL,使其浓度为100卩g/mL用70%乙醇将芦丁溶液 稀释成 10 种不同浓度（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 卩g/mL）的溶液 5 ml。

分别量取不同浓度的芦丁溶液1mL,同时加人70%乙醇1 mL、5%NaNO2溶液0.3 mL,混 匀后静置6 min,加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL,混匀，静置6 min,再加入4%NaOH溶 液2 mL,混匀，静置20 min,于510 nm波长处测定吸光度（A）测得线性回归方程2） 提取茶叶中的黄酮类化合物称取1g茶叶粉末于烧杯中，加入20mL70%乙醇，用保鲜膜封口，置于80°C恒温水浴 锅内1h,抽滤后得滤液3） 量取1mL滤液，加人70%乙醇1 mL、5%NaNO2溶液0.3 mL,混匀后静置6 min, 加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL,混匀，静置6 min,再加入4% NaOH溶液2 mL,混匀， 静置20 min,于510 nm波长处测定吸光度根据黄酮溶液的浓度与吸光度值成正比，吸光 度值越大，黄酮溶液浓度越大，可测定茶叶提取液中黄酮类物质的含量五、 注意事项乙醇浓度，样品和乙。