生物化学酪蛋白讲义.doc

实验五 酪蛋白的制备及含量测定一、实验目的1.学习和掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理和方法2.学习分光光度计的原理和操作方法二、实验原理牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调成4.7时，酪蛋白就沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对照，结果才可靠在半定量测定和纯蛋白的定量测定时，可用280nm的光吸收法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法。

紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛三、实验仪器及试剂95%乙醇(配100mL)、乙醇-乙醚混合液（V:V=1:1）(配200mL)0.2mol/L NaOH　（配250mL）0.2M pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液（配300mL）: A液：称NaAc·3H2O 54.44克，定容至2L B液：称醋酸 12克，定容至1L 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3L1mg/ml标准酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内用时配制成浓度为1mg/ml的溶液牛奶、无水乙醚、离心机、天平、滤纸（Φ=9cm）、表面皿、抽真空泵、抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）、40℃水浴、通风柜、紫外分光光度计、试管四、实验步骤1、等电点法制备酪蛋白将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃，将20mL牛奶加热至40℃，（牛奶和缓冲液预热的目的？）在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液，用精密pH试纸调pH至4.7（如果pH没有调至4.7，对得率有什么影响？），可见溶液变为乳白色悬浮液。

待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心8min，弃上清，得酪蛋白粗制品用6mL水洗脱沉淀1次（酪蛋白溶于水吗？），4000rpm离心5min，弃上清在沉淀中加入6mL 95％乙醇（乙醇作用？），搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗（什么作用？）中抽滤，用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次，最后用乙醚洗涤沉淀1次（乙醚什么作用？在什么环境中使用？），抽干将沉淀摊开在干净玻璃或培养皿上，风干，得酪蛋白纯品，准确称量，计算含量和得率注意含量和得率的区别）含量（g％）＝（酪蛋白g／100mL牛奶）×100％得率＝（测得含量／理论含量 ）×100％，理论含量为3.5g/100mL牛乳2、紫外吸收法测蛋白质含量（这步和上步的关系？上步中制得的酪蛋白是纯品吗？紫外吸收法测得的蛋白质含量准确吗？）（1）标准曲线的绘制（标准曲线的横纵坐标的单位是什么？1-8号管的横坐标对应的数值是？表中1-8号管的蛋白质浓度数值是怎么得来的?）取8支试管，编号后按下表加入试剂几号管是用来作对照调零的？）试剂 12345678标准蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/mL4.03.53.02.5 2.01.51.00蛋白质浓度/(mg/mL) 00.1250.250.3750.50.6250.751.0A280加完混匀后，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。

2）酪蛋白样品液制备测定配制酪蛋白含量在0.05～1.25mg/mL(为什么配成这个浓度？怎么配成这个浓度的溶液？)的待测样液进行吸光值测定为使酪蛋白溶解，可向样品中加入少量0.2mol/L NaOH，再用蒸馏水洗入100ml容量瓶中定容取待测酪蛋白溶液1.0mL置试管中，加入蒸馏水3ml，混匀，（以什么为对照调零？）按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测酪蛋白的浓度五、实验结果1、计算酪蛋白含量和得率，并指出实验步骤中会影响得率高低的具体操作2、根据紫外吸收法测出1.0mL样液中酪蛋白的浓度，计算出20mL牛奶中含有的酪蛋白质量并进一步计算出根据紫外吸收法得到的酪蛋白含量和得率3、比较等电点法制备酪蛋白质量和紫外吸收法计算出的酪蛋白质量，得出结论。