第七章-腺相关病毒载体(DOC 12页).doc

腺相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和RepITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合AAV能感染多种细胞Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AAVS1位点这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒重组腺相关病毒载体（rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

优点：以潜伏感染为主； AAV可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达缺点：AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥AAV选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大AAV的总容量4.7kb，还要包括AAV自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AAV载体对靶细胞具有较高的转导效率AAV病毒的感染细胞AAV载体对于骨骼肌、视网膜、肝细胞、心脏平滑肌细胞、神经元细胞、胰岛B细胞、关节滑膜细胞等具有良好的感染效果，而对于淋巴细胞、造血干细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等感染效果较差病毒的加样量病毒量为10-10V.P/Cell时最佳如果太低，基本检测不出，最低加病毒量为10V.P/Cell，才能检出目的蛋白的表达病毒要求本公司向客户提供三种rAAV载体--rAAV2、rAAV2/1载体的构建、扩增及纯化服务，包括了从实验设计到载体包装、生产、纯化、质量检定、分装等的一系列服务。

为基础研究、临床前研究和早期临床研究提供高滴度、高纯度的rAAV载体其中的对照病毒为携带GFP、LacZ和Luc标记除了AAV2和AAV2/1之外，我们也提供AAV1、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等具体情况请咨询本公司技术支持重组基因的启动子：mCMV、hCMV、PGK、CAG、HRE-miniCMV、hEF1α、AFP（大鼠）等其中，CAG启动子为肝脏特异启动子病毒级别实验室级别：适用于细胞实验、动物试验研究；临床试验用级别：适用于药物开发、临床前研究、临床样品申报、临床试验等腺病毒相关载体应用经过十几年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究（包括体内、体外实验）；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面目前已发现的AAV至少有十几种血清型，它们主要区别在衣壳蛋白Cap的不同，因此导致各种血清型AAV对不同的组织和细胞的不同感染效率9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性血清型组织亲和性AAV1肌肉，心脏，骨骼肌（包括心肌），神经组织AAV2中枢神经，肌肉，肝脏，脑组织，眼，AAV3肌肉，肝脏，肺，眼AAV4中枢神经，肌肉，眼，脑AAV5肺，眼，中枢神经，关节滑膜，胰腺AAV6肺，心脏AAV7肌肉，肝脏AAV8肝脏，眼，中枢神经，肌肉AAV9心脏，肌肉，肺（肺泡），肝脏，中枢神经腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体DNA共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成在AAV Helper-Free System中，rep和cap基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。

AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中本系统可以容纳最大插入3kb在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的特殊情况下，只能用pAAV-RC作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转在AAV载体生产和AAV储存液滴度测定步骤中，AAV Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统而传统的AAV载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AAV载体储存液进行共感染由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂在我们AAV Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。

重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具AAV Helper-Free System具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征AAV具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的AAV Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升浓缩及纯化方法见参考文献）AAV-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AAV-2在长期基因表达方面有特别重要的价值缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AAV-2基因组于染色体上，并能稳定表达高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力病毒整合进基因组也会发生，但是整合事件是罕见的如果进行极高的复感染或者细胞被感染过并表达腺病毒复制酶，整合事件发生的频率则会增加腺相关病毒用于基因传递和表达的优势较高的生物安全级别AAV-2是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。

在AAV Helper-Free System中，AAV-2 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AAV Helper-Free System一个较高的生物安全级别宿主细胞范围广腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人类和非人来蛋白的表达和其它病毒来源各种载体相比，已证明用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好高滴度按照此手册重组AAV-2可以生产出≥107 病毒颗粒/毫升的高滴度病毒文献报道病毒原液经浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞表达出的人类蛋白质可以正确的折叠和修饰因为AAV Helper-Free System可以传递基因进入宿主人类细胞系，所以利用此系统表达的人类蛋白质可以正确的进行翻译后的修饰和折叠长期的基因表达潜能重组AAV-2能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录潜能在所有的细胞群中，病毒基因组通常存在于染色体上，一般形成串联体这些串联体在缓慢分裂或非分裂细胞内稳定存在，在细胞群内长期进行基因转录和表达。

然而，在处于高速分裂的细胞群内，则会丢失染色体上AAV基因组病毒能整合今进宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达，但是这是稀有事件如果使用极高感染复数（MOI）的AAV进行感染或细胞被感染过野生型腺病毒并表达腺病毒复制酶，则整合发生的可能性会增加然而，使用野生型腺病毒来增加整合事件会降低AAV系统的生物安全性AAV Helper-Free System简述使用AAV Helper-Free System生产重组AAV颗粒示意图见图1第一步是把外源基因克隆进合适的载体大多数情况下，外源基因被克隆到一个包含ITR/MCS的载体中（pAAV-MCS 或pAAV-IRES-hrGFP）这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AAV-2复制和包装必须的顺式作用元件在一些情况下，插入到含ITR的载体的某些序列由于大肠杆菌内ITRs之间的同源重组而发生序列重排这时，外源基因应首先克隆进穿梭载体pCMV-MCS中，构建鉴定完成后，将包含表达框的Not I片段亚克隆进已经经Not I酶消化好的包含ITR的pAAV载体中重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV-2复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的所有反式作用因子）。

从被感染AAV-293细胞中收集AAV-2病毒颗粒，随后用于感染各种哺乳动物类细胞感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒病毒互补链的合成依赖于细胞复制因子这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。