叶绿素含量测定方法.doc
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实验 14 叶绿素 a 和 b 含量的测定（分光光度法）一、目的学会 Chla、b 含量的测定方法，了解叶片中 Chla、b 的含量二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721 分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml） 、漏斗、滤纸、乙醇（95%）三、原理叶绿素 a、b 在波长方面的最大吸收峰位于 665nm 和 649nm，同时在该波长时叶绿素a、b 的比吸收系数 K 为已知，我们即可以根据 Lambert Beer 定律，列出浓度 C 与光密度D 之间的关系式：D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)D649=24.54Ca+44.24 Cb…………………………….(2)(1)(2)式中的 D665、D 649为叶绿素溶液在波长 665nm 和 649nm 时的光密度为叶绿素 a、b 的浓度、单位为每升克数82.04、9.27 为叶绿素 a、b 在、在波长 665nm 时的比吸收系数16.75、45.6 为叶绿素 a、b 在、在波长 649nm 时的比吸收系数解方程式(1)(2)，则得 ：CA=13.7 D665—5.76 D649………………………(3)CB=25.8 D649—7.6 D665……………………… (4)G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649………(5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A、C B为叶绿素 a、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3） （4） （5）式，即可以计算叶绿素 a、b 及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤1．称取 0.1 克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇 10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到 25ml2．取一光径为 1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在 721 分光光度计下分别以 665nm 和 649nm 波长测出该色素液的光密度计算结果：叶绿素 a 含量（mg/g. FW）= 2.015AC叶绿素 b 含量（mg/g.FW）= .B叶绿素总量（mg/g.FW）= 2.01G五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量六、思考题测定叶绿素 a、b 含量为什么要选用红光的波长？3. 2 叶 绿 体 色 素 的 含 量 测 定原 理 根 据 叶 绿 体 色 素 提 取 液 对 可 见 光 谱 的 吸 收 ， 利 用 分 光 光 度 计 在 某 一 特 定 波 长下 测 定 其 吸 光 度 ， 即 可 用 公 式 计 算 出 提 取 液 中 各 色 素 的 含 量 根 据 朗 伯 -比 尔定 律 ， 某 有 色 溶 液 的 吸 光 度 A 与 其 中 溶 质 浓 度 C 和 液 层 厚 度 L 成 正 比 ， 即 ：A ＝ α CL式 中 ： α 为 比 例 常 数 。
当 溶 液 浓 度 以 百 分 浓 度 为 单 位 ， 液 层 厚 度 为1cm 时 ， α 为 该 物 质 的 吸 光 系 数 各 种 有 色 物 质 溶 液 在 不 同 波 长 下 的 吸 光 系 数 可通 过 测 定 已 知 浓 度 的 纯 物 质 在 不 同 波 长 下 的 吸 光 度 而 求 得 如 果 溶 液 中 有 数 种 吸 光 物 质 ， 则 此 混 合 液 在 某 一 波 长 下 的 总 吸 光 度 等 于 各 组分 在 相 应 波 长 下 吸 光 度 的 总 和 ， 这 就 是 吸 光 度 的 加 和 性 要 测 定 叶 绿 体 色 素 混 合 提取 液 中 叶 绿 素 a、 b 和 类 胡 萝 卜 素 的 含 量 ， 只 需 测 定 该 提 取 液 在 三 个 特 定 波 长 下的 吸 光 度 A， 并 根 据 叶 绿 素 a、 b 及 类 胡 萝 卜 素 在 该 波 长 下 的 吸 光 系 数 即 可 求 出其 浓 度 在 测 定 叶 绿 素 a、 b 时 ， 为 了 排 除 类 胡 萝 卜 素 的 干 扰 ， 所 用 单 色 光 的 波长 选 择 叶 绿 素 在 红 光 区 的 最 大 吸 收 峰 。
已 知 叶 绿 素 a、 b 的 80％ 丙 酮 提 取 液 在 红 光 区 的 最 大 吸 收 峰 分 别 为663nm 和 645nm， 又 知 在 波 长 663nm 下 ， 叶 绿 素 a、 b 在 该 溶 液 中 的 吸 光 系 数分 别 为 82.04 和 9.27， 在 波 长 645nm 下 分 别 为 16.75 和 45.60， 可 根 据 加 和 性原 则 列 出 以 下 关 系 式 ：A663＝ 82.04Ca+9.27Cb (1)A645＝ 16.75Ca+45.60Cb (2)式 （ 1） 、 （ 2） 中 的 A645 和 A663 为 叶 绿 素 溶 液 在 波 长 663 nm 和 645 nm时 的 吸 光 度 ， Ca、 Cb 分 别 为 叶 绿 素 a 和 b 的 浓 度 ， 以 mg·L-1 为 单 位 解 方 程 组 (1)、 (2)， 得 ：Ca＝ 12.72A663-2.59A645 (3)Cb＝ 22.88A645-4.67A663 (4)将 Ca 与 Cb 相 加 即 得 叶 绿 素 总 量 CT：CT ＝ Ca+ Cb ＝ 20.29A645+8.05A663 (5)另 外 ， 由 于 叶 绿 素 a、 b 在 652nm 的 吸 收 峰 相 交 ， 两 者 有 相 同 的 吸 光 系 数(均 为 34.5)， 也 可 以 在 此 波 长 下 测 定 一 次 吸 光 度 (A652)而 求 出 叶 绿 素 a、 b 总量 ：CT＝ A652×1000/34.5 (6)在 有 叶 绿 素 存 在 的 条 件 下 ， 用 分 光 光 度 法 可 同 时 测 定 出 溶 液 中 类 胡 萝 卜 素 的含 量 。
Lichtenthaler 等 对 Arnon 法 进 行 了 修 正 ， 提 出 了 80％ 丙 酮 提 取 液 中 三 种色 素 含 量 的 计 算 公 式 ：Ca＝ 12.21A663-2.81A646 (7)Cb＝ 20.13A646-5.03A663 (8)Cc ＝ (1 000A470 -3.27Ca-104Cb)/229 (9)式 中 ： Ca、 Cb 分 别 为 叶 绿 素 a 和 b 的 浓 度 ； Cc 为 类 胡 萝 卜 素 的 总 浓 度 ；A663、 A646 和 A470 分 别 为 叶 绿 体 色 素 提 取 液 在 波 长 663nm、 646nm 和 470nm下 的 吸 光 度 由 于 叶 绿 体 色 素 在 不 同 溶 剂 中 的 吸 收 光 谱 有 差 异 ， 因 此 ， 在 使 用 其 他 溶 剂 提取 色 素 时 ， 计 算 公 式 也 有 所 不 同 叶 绿 素 a、 b 在 95％ 乙 醇 中 最 大 吸 收 峰 的 波长 分 别 为 665nm 和 649nm， 类 胡 萝 卜 素 为 470nm， 可 据 此 列 出 以 下 关 系 式 ：Ca＝ 13.95A665—6.88A649 (10)Cb＝ 24.96A649—7.32A665 (11)Cc ＝ (1 000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 (12)材 料 、 仪 器 设 备 及 试 剂1. 材 料新 鲜 植 物 叶 片 。
2. 仪 器 设 备分 光 光 度 计 ； 电 子 天 平 (感 量 0.01g)； 研 钵 ； 棕 色 容 量 瓶 ； 小 漏 斗 ； 滤 纸 ；吸 水 纸 ； 擦 镜 纸 ； 滴 管 3. 试 剂 （ 1） 95％ 乙 醇 (或 80％ 丙 酮 ) 2） 石 英 砂 3） 碳 酸 钙 粉 方 法1． 取 新 鲜 植 物 叶 片 (或 其 他 绿 色 组 织 )或 干 材 料 ， 擦 净 组 织 表 面 污 物 ， 剪碎 (去 掉 中 脉 )， 混 匀 2． 称 取 剪 碎 的 新 鲜 样 品 0.2g， 共 3 份 ， 分 别 放 入 研 钵 中 ， 加 少 量 石 英 砂和 碳 酸 钙 粉 及 2～ 3ml 95％ 乙 醇 (或 80％ 丙 酮 )， 研 成 匀 浆 ， 再 加 乙 醇 10ml，继 续 研 磨 至 组 织 变 白 静 置 3～ 5min3． 取 滤 纸 1 张 ， 置 漏 斗 中 ， 用 乙 醇 湿 润 ， 沿 玻 棒 把 提 取 液 倒 入 漏 斗 中 ， 过滤 到 25ml 棕 色 容 量 瓶 中 ， 用 少 量 乙 醇 冲 洗 研 钵 、 研 棒 及 残 渣 数 次 ， 最 后 连 同 残 渣一 起 倒 入 漏 斗 中 。
4． 用 滴 管 吸 取 乙 醇 ， 将 滤 纸 上 的 叶 绿 体 色 素 全 部 洗 入 容 量 瓶 中 ， 直 至 滤 纸 和残 渣 中 无 绿 色 为 止 最 后 用 乙 醇 定 容 至 25ml， 摇 匀 5． 把 叶 绿 体 色 素 提 取 液 倒 入 光 径 1cm 的 比 色 杯 内 以 95％ 乙 醇 为 空 白 ，在 波 长 665nm、 649nm 和 470nm 下 测 定 吸 光 度 6. 结 果 计 算按 公 式 (10)、 (11)、 (12)(如 用 80％ 丙 酮 ， 则 按 公 式 7、 8、 9)分 别 计 算 叶绿 素 a、 b 和 类 胡 萝 卜 素 的 浓 度 (mg·L-1) (10)、 (11)式 相 加 即 得 叶 绿 素 总 浓 度 求 得 色 素 的 浓 度 后 ， 再 按 下 式 计 算 组 织 中 单 位 鲜 重 或 干 重 的 各 种 色 素 的 含 量 ：A＝ n·C·N·W-1（ mg·g-1）A－ 叶 绿 体 色 素 的 含 量 ；C－ 色 素 的 浓 度 ；n－ 提 取 液 体 积 ；N－ 稀 释 倍 数 ；W－ 样 品 鲜 重 。
注 意 事 项1． 为 了 避 免 叶 绿 素 光 分 解 ， 操 作 时 应 在 弱 光 下 进 行 ， 研 磨 时 间 应 尽 量 短 些 2． 叶 绿 体 色 素 提 取 液 不 能 混 浊 可 在 710nm 或 750nm 波 长 下 测 量 吸 光 度 ， 其 值 应小 于 当 波 长 为 叶 绿 素 a 吸 收 峰 时 吸 光 度 值 的 5％ ， 否 则 应 重 新 过 滤 3． 用 分 光 光 度 计 法 测 定 叶 绿 素 含 量 ， 对 分 光 光 度 计 的 波 长 精 确 度 要 求 较 高 如 果 波 长 与原 吸 收 峰 波 长 相 差 1nm， 则 叶 绿 素 a 的 测 定 误 差 为 2％ ， 叶 绿 素 b 为 19％ ， 使 用 前 必 须对 分 光 光 度 计 的 波 长 进 行 校 正 校 正 方 法 除 按 仪 器 说 明 书 外 ， 还 应 以 纯 的 叶 绿 素 a 和b 来 校 正 4． 在 使 用 低 档 型 号 分 光 光 度 计 (如 722 型 、 721 型 等 )测 定 叶 绿 素 a、 b 含 量 时 ， 。
