第九章DNA序列测定.ppt

铲瞥匠扩罩墟煤腕排逞氮榜读捕莉巨胎盟奥稳缝灯肉穷褥簿瑚耕这炳挡帅第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定第九章第九章 DNA DNA序列测定序列测定副鄙霞映柔嚼众固胃荣啸筷延慕缄弧揣肥石本则俗球翱轮跪譬罕细歉沃语第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定铲瞥匠扩罩墟煤腕排逞氮榜读捕莉巨胎盟奥稳缝灯肉穷褥簿瑚耕这炳挡帅第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定第一节第一节 概概 述述一、一、DNA序列测定序列测定 即即核酸核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术重要的技术　　　　 1963年，年，SangerSanger和和ThompsonThompson等人第一次完成胰岛素等人第一次完成胰岛素51个个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事70年年代后期，代后期，SangerSanger和和Maxam----GilbertMaxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测等人又建立了核酸序列测定的方法，定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学化学裂解法将核酸序列测定技术推进到裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读直读”阶段，使核酸序列阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。

核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列靠贵漓腺妇所届伏懦宴迫立孝嗜齐帕最泛涩愚羡史揽妖槽套铜蝴哟睬得比第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定二、二、DNA序列测定工作原理序列测定工作原理 在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的置的A、、T、、G或或C碱基，将待测碱基，将待测DNA片段转变成一系列放片段转变成一系列放射性核素标记的单链射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基个碱基的连续末端经电泳分离，放射自显影，可直接读出的连续末端经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列迈渝沂襟仕菲祸翁顺饺承挑胞弧廖怠朗离鲤赂临赏砂归掉苟断销贰迢犊帘第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定三、核酸序列分析的目的意义和策略三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（具体方法）（具体方法）（具体方法）（一）序列分析的目的，（一）序列分析的目的，（一）序列分析的目的，（一）序列分析的目的，2 2种：种：种：种： 1 1、确证性测序、确证性测序、确证性测序、确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。

已知基因序列）差异已知基因序列） 2 2、从头序列、从头序列、从头序列、从头序列 目的是提供一段目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列未知基准确的核苷酸序列未知基因序列）因序列）（二）测定在生物医学领域相应应用，（二）测定在生物医学领域相应应用，（二）测定在生物医学领域相应应用，（二）测定在生物医学领域相应应用，2 2个方面：个方面：个方面：个方面： 1 1、、、、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案 2 2、、、、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序三）序列分析的策略（具体方案）（三）序列分析的策略（具体方案）（三）序列分析的策略（具体方案）（三）序列分析的策略（具体方案） 测序目的不同或靶测序目的不同或靶DNA片段大小有区别，则序列分析的具体方案片段大小有区别，则序列分析的具体方案有所不同，所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略，这个问有所不同，所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略，这个问题在后面将涉及到，但由于学时限制，不可能完全展开来讲，请同学参题在后面将涉及到，但由于学时限制，不可能完全展开来讲，请同学参看相关书籍。

看相关书籍峡滞洒狡徊柱未认愤菌雏锐嵌可参那欠漏韭凯痪挥独膏茸刮专巾泰幽孽巾第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定四、测序的常用方法四、测序的常用方法DNADNA序列测定常用方法有如下序列测定常用方法有如下3 3种：种： 1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出优点简便、迅速、应用广泛不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h嗽狙脱搭欢疏栓斯变型海老暂炕谩绕痔亿纵摘虑烽磷帝口届豺戚雕醛叼交第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定 不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1 1、制备待测、制备待测、制备待测、制备待测DNADNA序列模板；序列模板；序列模板；序列模板； 2 2、酶促或化学反应将其转变、酶促或化学反应将其转变、酶促或化学反应将其转变、酶促或化学反应将其转变“ “等差数列等差数列等差数列等差数列” ”（（（（n=1n=1）；）；）；）； 3 3、、、、PAGEPAGE；；；； 4 4、读序。

读序P255,图图10-2））五、测序的基本过程五、测序的基本过程裙系辅涣箱榜演部溺域熟姜缘矛拆众谗侗霄揽健绷毅邢辖悄治软这肌前圾第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定六、测序技术的最近发展六、测序技术的最近发展 1 1、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒、商品化测序试剂盒 解决了质粒问题，节省了时间，解决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性但缺乏灵活性 2 2、自动化测序仪、自动化测序仪、自动化测序仪、自动化测序仪 以酶学测序反应或（和）放标测序产以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础，微机处理物为基础，微机处理 3 3、热循环测序、热循环测序、热循环测序、热循环测序 使极少数测序产物线性放大使极少数测序产物线性放大 4 4、测序商品化、测序商品化、测序商品化、测序商品化 60.-180.￥，搞定疾嘴谬别桐姿曳厚鸵以棍吟商热嫡倡锻妒杜喊雅莽目锄万盾迈张姬福扣瘫第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定七、七、DNA序列测定的应用序列测定的应用分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列分析基因序列分析基因序列分析基因序列分析基因序列基因定点诱变的基础基因定点诱变的基础基因定点诱变的基础基因定点诱变的基础 基因工程载体构建中基因工程载体构建中基因工程载体构建中基因工程载体构建中DNADNA序列定位和排序的基础序列定位和排序的基础序列定位和排序的基础序列定位和排序的基础确定确定确定确定DNADNA序列中蛋白质的编码区序列中蛋白质的编码区序列中蛋白质的编码区序列中蛋白质的编码区醉寄稠肆衡蓑离揽巨斯刻使砰椽犯隙示草颁银奉胯阀忠鼠输仗弦甫丫俗丁第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定第二节第二节 Sanger双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法一、原一、原 理理（一）（一）（一）（一）DNADNA复制的复制的复制的复制的4 4个基本条件个基本条件个基本条件个基本条件 1 1、、、、ssDNAssDNA模板模板模板模板 2 2、、、、DDDPDDDP 3 3、带有、带有、带有、带有3’-OH3’-OH末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物 4 4、、、、4 4种种种种dNTPdNTP（二）链终止剂（（二）链终止剂（（二）链终止剂（（二）链终止剂（chain-reminatorchain-reminator））））----2----2，，，，3-3-二脱氧核糖核酸酶二脱氧核糖核酸酶二脱氧核糖核酸酶二脱氧核糖核酸酶 当当3’-OH由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成磷酸形成3’，，5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。

如果用相磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处如果用相同的同的4组引物组引物-模板混合物，每一组加模板混合物，每一组加4种种dNTP，其中，其中1种用种用32P（或（或35S）标记，加）标记，加1种种ddNTP，每组将产生一种特异性的以，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端为末端的不同长度的核苷酸链，经的不同长度的核苷酸链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序分离，即可读出被测定的全部顺序（（dNTP和和ddNTP竞争结合底物）竞争结合底物）P255，图，图10-2））纹削敏刨秸胚宵勾例艰贺勺剂供瞧捅泰撬贼遵吸鼻怔柄芦融蜒时蔚券适谤第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（三）（三）（三）（三） Sanger Sanger双脱氧链终止法的原理双脱氧链终止法的原理双脱氧链终止法的原理双脱氧链终止法的原理 在在DNA合成时，利用合成时，利用ddNTP与与dNTP竞争掺入到新竞争掺入到新生的生的DNA链上使链终止的原理即在链上使链终止的原理即在A、、C、、G、、T 4种种反应体系中，分别加入不同的反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的经酶促合成反应，生成具有相同的5′末端，而末端，而3′不同的不同的DNA片段的混合物。

经电泳分离，放射自显影，直接片段的混合物经电泳分离，放射自显影，直接读出读出DNA的核苷酸序列的核苷酸序列酝帆嚏嫁乡痴臭参胸两千淮脑六诱官誓义荫婿啤詹慷量桌莫雕鲤服潜寄隙第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定二、试二、试 剂剂（一）引物（一）引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为酸作为DNA合成的引物合成的引物 在许多情况下可将靶在许多情况下可将靶DNA片段克隆于片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链以取得单链DNA分子作为模板也可用分子作为模板也可用Sanger法测定变性双链法测定变性双链DNA模板序列（如变性质粒模板序列（如变性质粒DNA）以上两种情况都可以采用能）以上两种情况都可以采用能与位于靶与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知知DNA序列互补的引物序列互补的引物M13噬菌体重组子的通用测序引物一般噬菌体重组子的通用测序引物一般长长15-29bp，与紧靠，与紧靠M13mp18多克隆位点区的多克隆位点区的HindIII或或M13mp19多克隆位点区多克隆位点区EcoRI位点的序列互补。

这些引物同样也可用于位点的序列互补这些引物同样也可用于PUC质粒的质粒的DNA进行进行“双链双链”测序，并且已经商品化测序，并且已经商品化崖蔗侩谎着凹品闪蓟上犀酱廊蒜吼壕蜘秦奥七些热哪妊呛衙醒点卞蝴迟巩第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（二）模板（二）模板（二）模板（二）模板 纯单链纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以都可以用作用作Sanger法测定的模板模板的质量和所用的法测定的模板模板的质量和所用的DNA聚合聚合酶的种类是至关重要的酶的种类是至关重要的 通常采用通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果模板效果最佳，用变性双链最佳，用变性双链DNA作模板则难获此效果小量制备质作模板则难获此效果小量制备质粒粒DNA常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清采用小量制备质粒止现象，使测序胶含糊不清采用小量制备质粒DNA测定测定未知未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒锭梯度离心结果纯化质粒DNA，测序结果会好得多，但又，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。

耗费大量的人力和物力夺继胜晋厅算闽衰媳逮棒乃阵萍迟拼椅猴舶矣蒸署咽斧贝恩梅岛夫拈盲耀第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定DNADNA序列测定模板制备方法序列测定模板制备方法 因为因为DNA是相当大的分子，一般由几是相当大的分子，一般由几kb组成，最小的质粒和病毒组成，最小的质粒和病毒也在也在1kb以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个bp（以（以300-500bp为好，为好，300bp最佳），所以测序前，可以用最佳），所以测序前，可以用2种限制酶消化待测种限制酶消化待测DNA，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收回收片段，，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收回收片段，如果超过如果超过700-800bp，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收然，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收然后分别测定每个片段的顺序由于两种限制酶在后分别测定每个片段的顺序由于两种限制酶在DNA链上的切点位置链上的切点位置不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据2片段的这种末端重叠现片段的这种末端重叠现象，用计算机定出各片段的位置，而排出象，用计算机定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。

的全部序列 在测序中，小片段在测序中，小片段DNA只需直接克隆到只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，或者质粒载体中，进行双链或单链模板测序现在常用的进行双链或单链模板测序现在常用的M13mp载体一般是成对设计，载体一般是成对设计，如如M13mp18与与M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反同一都有相同的多克隆位点，但方向相反同一待测的待测的DNA片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序对于数对于数kb大片段大片段DNA分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克隆，原位亚克隆，包含上述用隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化种限制酶消化DNA等客尧沈踪贾搏惯认仕后赁腾浸食嫂蝉庇谅浅掳褂洒罚毙耿矗宵随畏溯鸽壮第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定1 1、用噬菌体、用噬菌体、用噬菌体、用噬菌体M13M13克隆待测克隆待测克隆待测克隆待测DNADNA片段片段片段片段 1 1）噬菌体）噬菌体）噬菌体）噬菌体----是寄生在细菌的病毒存在是寄生在细菌的病毒。

存在3种状态，有尾种状态，有尾20面体，无尾面体，无尾20面体和丝状单链噬菌体（面体和丝状单链噬菌体（filamentous），），M13是一类雄性特异的大肠杆是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的菌噬菌体，含单链环状的DNA它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA（（Replicative form DNA，，RF DNA），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝成熟的噬菌体成为单链），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝成熟的噬菌体成为单链（正链、（正链、RF则以正链为模板复制则以正链为模板复制1条链，再以此链复制正链）分泌到培养液条链，再以此链复制正链）分泌到培养液中因此双链中因此双链DNA（（RF）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆所用的载体从培养上清液提取成熟的单链所用的载体从培养上清液提取成熟的单链DNA做为测序模板做为测序模板 在感染过程中，在感染过程中，M13并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制。

并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制dsDNA复制又产生大量的复制又产生大量的ssDNA，它被，它被1个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是M13不同于其他噬菌不同于其他噬菌体的特点每体的特点每ml培养液沉淀的噬菌体可提取培养液沉淀的噬菌体可提取5-10mgssDNA，产量是很高的产量是很高的用作克隆载体，用作克隆载体，M13有有1个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源DNA其中其中1条链的条链的DNA分子，后者可在下列工作中充作模板：分子，后者可在下列工作中充作模板： （（（（1 1）末端终止法测序）末端终止法测序）末端终止法测序）末端终止法测序 （（（（2 2）制备）制备）制备）制备“ “放标放标放标放标” ”单链用于杂交单链用于杂交单链用于杂交单链用于杂交DNADNA探针探针探针探针 （（（（3 3）利用寡核苷酸进行定点诱变利用寡核苷酸进行定点诱变利用寡核苷酸进行定点诱变利用寡核苷酸进行定点诱变。

陌斥腹蕴知术彪辆之哲驻处意嚷念稚牌愧掷积摧册奸他忻帅崖雇雹蜒试债第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定2 2））））M13mp18M13mp18和和和和M13mp19M13mp19载体载体载体载体 （（（（1 1））））mpmp系列载体特点：系列载体特点：系列载体特点：系列载体特点： ①①①①都是从同一重组都是从同一重组M13mp1改造而来改造而来 ②②②②在基因在基因II-IV（（500bp，，570bp左右）之间有左右）之间有1个多克隆位点个多克隆位点（（multiple cloning sites，，MCS）可供外源基因插入可供外源基因插入 ③③③③该区域（该区域（MCS）插入了）插入了1小段小段Ecoli.DNA，有，有β-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（（LacZ）的调控序列及其）的调控序列及其N端端146个个aa编码信息，它与宿主菌（含编码信息，它与宿主菌（含LacZ））α-互补，形成有活性的互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，使平板上底半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成蓝生色成蓝噬菌斑，当外源基因插入噬菌斑，当外源基因插入MCS，破坏了，破坏了α-互补，几乎无一例外生成无色互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。

这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志白）噬斑这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志 （（（（2 2））））M13mp18M13mp18和和和和M13mp19M13mp19是一对载体，它们有相同的是一对载体，它们有相同的13个多克隆个多克隆位点，但方向相反当位点，但方向相反当RF DNA被两种限制酶切割后，被两种限制酶切割后，M13mp18和和M13mp19轻易不能重新环化，当连接混合液中含外源匹配末端轻易不能重新环化，当连接混合液中含外源匹配末端dsDNA片片段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入这样段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入这样M13mp18正链中含有外源正链中含有外源DNA的一条链，而在的一条链，而在M13mp19正链中含外源正链中含外源DNA的另一条链）所以的另一条链）所以M13mp18和和M13mp19作为一对载体可用同一通作为一对载体可用同一通用引物，（从所插入用引物，（从所插入DNA片段任一端开始），测定互为相反两条链的片段任一端开始），测定互为相反两条链的DNA序列并可制备只与外源序列并可制备只与外源DNA任意任意1条条DNA链互补的探针）。

分子克链互补的探针）分子克隆隆P202）刀据壳聚饮睦浊桐拜暖刁遣儿著拈贾迢农捆瞧唉阁氧泌诲蘑半赘杀檬寥穿第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定2 2、定向连续次级克隆待测大片段、定向连续次级克隆待测大片段、定向连续次级克隆待测大片段、定向连续次级克隆待测大片段DNADNA片段片段片段片段 测定数测定数kb的的DNA序列时，可以建立一系列一端删切序列时，可以建立一系列一端删切200-300bp的的DNA片段次级克隆对它们分别测序，就可以连续读出该大片段片段次级克隆对它们分别测序，就可以连续读出该大片段DNA的的全部序列核酸酶全部序列核酸酶BAL31和核酸外切酶和核酸外切酶III，均可以达到连续删切的目的均可以达到连续删切的目的 核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶BAL31-BAL31----是从乳白短杆菌（是从乳白短杆菌（Brevibacterium albidum）细）细菌中分离它能以渐进的方式将线型菌中分离它能以渐进的方式将线型DNA分子的分子的3’，，5’两端同时降解，两端同时降解，形成小的寡核苷酸片段或单核苷酸底物可以是带延伸末端的，也可以形成小的寡核苷酸片段或单核苷酸。

底物可以是带延伸末端的，也可以是平头末端的是平头末端的dsDNA，对，对3’，，5’两端降解有同样性，此酶要求两端降解有同样性，此酶要求Ca2+作辅作辅因子，以因子，以EDTA作螯合剂，可使该酶失活作螯合剂，可使该酶失活 BAL31还有较弱的单链特异内切酶活性，与核酸酶还有较弱的单链特异内切酶活性，与核酸酶S1相似，降解相似，降解ssDNA或或ssRNA形成形成5’磷酸末端的单或寡核苷酸酶片段，能从磷酸末端的单或寡核苷酸酶片段，能从DNA片片段中切除单链尾巴，产生平头末端核酸酶段中切除单链尾巴，产生平头末端核酸酶S1是从米曲霉是从米曲霉（（Aspergillus Oryze）中分离的中分离的 外切核酸酶外切核酸酶外切核酸酶外切核酸酶III-III----是一种从是一种从E.coli中分离，从中分离，从dsDNA的的3’-OH末端降末端降解产生解产生5’单核苷酸的外切酶此外，外核酸酶单核苷酸的外切酶此外，外核酸酶III还有内核酸酶，还有内核酸酶，RnaseH和和3’-磷酸酶的活性磷酸酶的活性生骚虞塌伯胆抒胶侣赎咕砌院露黔仲脂辊喝梯敝振述区汛拽慰牙夸盾匪绝第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（三）（三）DNADNA聚合酶聚合酶1 1、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I KlenowI Klenow大片段大片段大片段大片段 Klenow大片段大片段----DDDPI是由分子量是由分子量109KD一条多肽链组成，此酶可一条多肽链组成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成被枯草杆菌蛋白酶分解成2个片段，个片段，1个片段分子量为个片段分子量为76KD，有聚合酶，，有聚合酶，3’→5’外切酶活力，此片段称为外切酶活力，此片段称为Klenow片段，另一片段片段，另一片段34KD，有，有5’→外切外切酶活力。

酶活力 此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物250个核苷酸以个核苷酸以内的序列此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列内的序列此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列DNA次级克隆的鉴定仍次级克隆的鉴定仍有应用价值有应用价值2 2、测序酶（、测序酶（、测序酶（、测序酶（SequenaseSequenase）））） 测序酶是经过改造的测序酶是经过改造的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶，消除了聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性外切酶活性活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA序列的首选酶该酶及名称是序列的首选酶该酶及名称是HSB公司的专利试剂盒已商品化公司的专利试剂盒已商品化3 3、、、、TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 Taq酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（70-80℃℃）进行反应的优点，因而能克服富含）进行反应的优点，因而能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构序列的模板形成自身二级结构对测定的影响，将对测定的影响，将PCR与末端终止法测序结合进行，只需少量模板。

与末端终止法测序结合进行，只需少量模板酚翟率驻伞袜锯哈室棵遏眼祸脑酣沦发爽夕虑跟凌前轴冒洲病霞萄赫账握第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（四）放射性同位素标记的（四）放射性同位素标记的dNTPdNTP 传统传统32P-dNTP，由于，由于32P衰变过程中产生高能的衰变过程中产生高能的β射线，导致射线，导致放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量另放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量另外，由于外，由于32P对对DNA样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应后样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应后24小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果 α-32S-dNTP近年来得到广泛使用，它解决了近年来得到广泛使用，它解决了32P的两大缺点，的两大缺点，具有很高的分辨率，较低的本底测序反应产物具有很高的分辨率，较低的本底测序反应产物-20℃℃保存一周并保存一周并不明显影响反应结果不明显影响反应结果五）用于测序的变性凝胶电泳 胶长胶长胶长胶长40cm40cm，厚度均匀，厚度均匀，厚度均匀，厚度均匀 4~8% 4~8%丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺 7mol/L 7mol/L尿素尿素尿素尿素 怒寐艾港昌洞搂杯疹勃奠懦古篮硝描厄柑粟事绽迁阎演矛泉苦羚然篡铁邪第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定三、三、Sanger法测序主要反应（实习讲义法测序主要反应（实习讲义P138））（一）制胶（一）制胶（二）模板变性（双链）（二）模板变性（双链）（三）测序反应（三）测序反应 1、模板引物退火、模板引物退火 2、链延伸、链标记、链终止反应、链延伸、链标记、链终止反应 3、上样电泳、上样电泳 4、读片（序）、读片（序） （分子克隆（分子克隆P640）） （必须经过实践才能获得技巧）（必须经过实践才能获得技巧）奈糟崩腮涎呜氮鸭船找碑蚂帧朋痕潜糕缩藉贿驼架搭台都吵粮访豹停湘睡第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定四、大片段四、大片段DNA的测序方法的测序方法（一）随机法（一）随机法（一）随机法（一）随机法 超声波处理：将超声波处理：将超声波处理：将超声波处理：将DNADNA随机断裂成一组相互重叠的随机断裂成一组相互重叠的随机断裂成一组相互重叠的随机断裂成一组相互重叠的300~900bp300~900bp片段，电泳回收片段，电泳回收片段，电泳回收片段，电泳回收300~600bp300~600bp片断作亚克隆片断作亚克隆片断作亚克隆片断作亚克隆 DNaseI DNaseI切割：将切割：将切割：将切割：将DNADNA随机切割成一组相互重叠的片随机切割成一组相互重叠的片随机切割成一组相互重叠的片随机切割成一组相互重叠的片段，作亚克隆段，作亚克隆段，作亚克隆段，作亚克隆 限制酶消化：限制酶将限制酶消化：限制酶将限制酶消化：限制酶将限制酶消化：限制酶将DNADNA切割为含粘端的切割为含粘端的切割为含粘端的切割为含粘端的DNADNA片片片片段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行段，作亚克隆将上述含不同子片段的亚克隆扩增后进行测序测序测序测序兆旧励帜鸦衔杨水继听牌忘目叶追摇盈桃潞识笺警骡糯磊涂扳纫哑元叉控第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（二）嵌套缺失法（二）嵌套缺失法（二）嵌套缺失法（二）嵌套缺失法 1、将待测、将待测DNA与与M13mp载体相连，构成重组体。

载体相连，构成重组体 2、用两种限制酶从待测、用两种限制酶从待测DNA片段的一端与载体序列之片段的一端与载体序列之间将间将DNA切断，产生线性切断，产生线性DNA，使近待测，使近待测DNA片段的一端片段的一端为为5′突出末端，近载体一端为突出末端，近载体一端为3′突出末端突出末端 3、外切核酸酶、外切核酸酶Ⅲ从从5′突出末端消化待测突出末端消化待测DNA，，37°C时，时，每分钟水解每分钟水解250个核苷酸个核苷酸 4、核酸酶、核酸酶SI去除残余单链，自我环化，转化或转染宿去除残余单链，自我环化，转化或转染宿主菌得到次级克隆主菌得到次级克隆 5、将各克隆用于测序将各克隆用于测序篱揉幢耍舷署弊妙限忻旁妆疟甩局蹲奸吴仇撤遭乓遍煤冤记眨豺锨爹密实第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（三）引物延伸法（三）引物延伸法 是一种定向测序法，从是一种定向测序法，从DNA的的3′依赖特定引依赖特定引物延伸测定一段物延伸测定一段DNA序列，再根据测得序列设计序列，再根据测得序列设计新的引物，作下一延伸反应的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反应的引物，如此向前推进，最终测得进，最终测得DNA的全长序列。

的全长序列建殴须往谱嘛疤堕饲逗虹始挑脏坍图本符狗联矫蚜贫铱好酣门肿练砒应股第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定第三节第三节 Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法 化学裂解化学裂解化学裂解化学裂解（直读，（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）法双脱氧末端法也是直读法）法是是Maxam和和Gilbert等人等人1977年创建的，用来测定年创建的，用来测定DNA序列化学法是用化学试剂在化学法是用化学试剂在A、、G、、C、、T处特定地裂解处特定地裂解DNA片段，片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过），经过PAGE和和放射自显影后，可以直接读出放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序 某些试剂能修饰或破坏某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而链上特定核苷酸的碱基进而使使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在消除反应，在3’和和5’位位上断裂磷酸二酯键使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸上断裂磷酸二酯键使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。

二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环4种核苷酸的特异裂解种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下：和鉴别方法如下：钠必抑量朵蛾杆具崎相耗肯撂移盲绳娜撬欧削私诌霓暖账产动迎坝镀胎勋第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定一、化学裂解法测序的原理一、化学裂解法测序的原理1、用放射性核素标记待测、用放射性核素标记待测DNA一侧末端一侧末端2、将标记、将标记DNA分为分为G、、A+G、、C+T、、C 4个反应体系个反应体系3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出读出DNA序列序列寻锈撼攀芝挣越涛必懒疫熊沮毗诵讣等那涟钵杨瓷娄爽摩蛹审瓢桨睫视嗡第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定表表表表--------特异断裂特异断裂特异断裂特异断裂4 4种脱氧核苷酸的方种脱氧核苷酸的方种脱氧核苷酸的方种脱氧核苷酸的方法法法法作用的碱基作用的碱基试剂与反与反应碱基碱基释放放DNA断裂断裂强强G/弱弱A稀稀释250倍硫酸二甲倍硫酸二甲酯，在，在50mM卡可酸卡可酸（（PH8.0））10MMgCl2、、0.1MEDTA20℃0℃60分分钟，，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化甲基化嘌嘌呤不呤不稳定，定，在中型在中型PH加加热被破坏被破坏在在0.1M碱中，碱中，90℃℃15分分钟，戊糖脱，戊糖脱落，落，DNA链断裂，断裂，G断裂比断裂比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、、0℃℃、、60分分钟，碱基被破坏，碱基被破坏同上，同上，A断裂比断裂比G快快C+T15-18M联苯胺、苯胺、20℃℃50分分钟，，嘧啶环被破坏被破坏释放放0.5M哌啶处理，断裂理，断裂DNA键，，C与与T有同有同样速率速率C2MNaCl，，联氨氨处理方法同上，理方法同上，100分分钟，此，此时，，T的的破坏被抑制，只有破坏被抑制，只有C被破坏被破坏释放放同上，只在同上，只在C处断裂断裂DNA链朝宏阴淳最作冷株糟陇轴衙潘痢撑杠灭悄胯唬借旨恩探婆谩顷蹬减荷毛关第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定在在在在4 4种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNADNA的机制是：的机制是：的机制是：的机制是： G反应反应----硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。

间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合 G+A反应反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤然后哌啶置换了嘌呤 T+C反应反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换 C反应反应----在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换事米蒂堪潦檀逃纲同菱猿测坛参酿频拍伸连尔准黔厨书宿寺擞侍混御碰首第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定二、碱基特异性修饰及裂解二、碱基特异性修饰及裂解反应体系反应体系反应体系反应体系碱基修饰试剂碱基修饰试剂碱基修饰试剂碱基修饰试剂碱基修饰反应碱基修饰反应碱基修饰反应碱基修饰反应主链断裂试剂主链断裂试剂主链断裂试剂主链断裂试剂断裂点断裂点断裂点断裂点GG硫酸二甲酯硫酸二甲酯硫酸二甲酯硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化鸟嘌呤甲基化六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶GGG+AG+A甲酸甲酸甲酸甲酸脱嘌呤作用脱嘌呤作用脱嘌呤作用脱嘌呤作用六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶GG和和和和A AC+TC+T肼肼肼肼嘧啶开环嘧啶开环嘧啶开环嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶C C和和和和T TC C肼（加盐）肼（加盐）肼（加盐）肼（加盐）胞嘧啶开环胞嘧啶开环胞嘧啶开环胞嘧啶开环六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶六氢吡啶C C衍挝暇搀穆磨婆都涨密萨使伊补亚澜厕蕊汲酱祝位拘塞驻谈铂氧窒人红鲍第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定（一）（一）（一）（一）限制酶消化待测限制酶消化待测DNA，得到长度为，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回的一组片段，纯化回收每收每1个片段作为测序材料。

个片段作为测序材料二）（二）（二）（二）碱性磷酸酶处理消除碱性磷酸酶处理消除5’磷酸三）（三）（三）（三）多核苷酸酶催多核苷酸酶催32PdNTP标记（标记（5’-OH）末端四）（四）（四）（四）使标记片段变性为单链使标记片段变性为单链五）（五）（五）（五）分成分成4-5个反应体系，按上述程序（表或个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格个机制）化学处理，严格控制反应条件使得平均每控制反应条件使得平均每1个个DNA分子只有分子只有1个位置被断裂，这种断裂个位置被断裂，这种断裂是随机的，如是随机的，如G反应，则在反应，则在DNA链上任意位置链上任意位置G断裂），断裂），DNA链上每链上每50-100碱基只有碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的组不同长度的DNA片段其长度可片段其长度可由几个核苷酸到接近待测由几个核苷酸到接近待测DNA全长六）（六）（六）（六）电泳电泳（七）（七）（七）（七）放射自显影放射自显影（八）（八）（八）（八）4个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。

全部核苷酸序列就可直接读出二、化学法测序的基本步骤二、化学法测序的基本步骤（三、四略讲）（三、四略讲）游肆郧汾滞藤洒乳幕橡冻毗贪嫩苟括漱关嚎一搂来学涯帆拦错棱蔗涉哉句第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定三、化学法的优点三、化学法的优点 化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究验来研究DNA二级结构及蛋白质与二级结构及蛋白质与DNA的相互作用的相互作用避折刷某姥咯狭盾辑镰邪逐窃收谁况锑洞刀吮堑亿量迂拧篱捣贼湿杯菌幕第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定三、化学裂解法的特点三、化学裂解法的特点 不需酶催化不需酶催化不需酶催化不需酶催化 5 5 ′ ′和和和和3 3 ′ ′端均可标记，可从两方向测同一端均可标记，可从两方向测同一端均可标记，可从两方向测同一端均可标记，可从两方向测同一DNADNA 操作繁琐、费时、分辨率较低操作繁琐、费时、分辨率较低操作繁琐、费时、分辨率较低操作繁琐、费时、分辨率较低沾尊侠揍澈勺赌用泰弘睡国锈翼球詹综桨腻愤饼蛾霉拓雀桶鸥离郑敞卤档第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定四、化学法读序四、化学法读序 化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是因为化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或或5条垂直的条垂直的阶梯带，阶梯带，A>C反应可以不做。

该片从胶底部一个个向顶部读，反应可以不做该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列中含有所有相差一个碱基的两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段如果片段如果G+A中出现中出现1条带就条带就看看G列中是否有同样大小的带，若有即为列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T中则检查中则检查C列中有无同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无则为，无则为T在做了A>C反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基化学法必须碱基化学法必须4或或5个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA中中4个碱基每个位置都有个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测个相应的片段，待测的的DNA全部序列可直接读出专业技术人员）全部序列可直接读出专业技术人员） 化学法测序采用化学法测序采用32P标记标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以内读序常见问题及解决办法参见分子克隆读序常见问题及解决办法参见分子克隆P665。

末端法读序（分子克隆末端法读序（分子克隆P640））堤楷氟莫凉刨剂拦师贬腾贤魏牛氛熊套命贞乐镁津司强碎媒疹蒲索谨廖泽第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定第三节第三节 DNA测序自动化和大规模测序测序自动化和大规模测序特点特点特点特点原理同末端终止法原理同末端终止法原理同末端终止法原理同末端终止法标记物为荧光染料标记物为荧光染料标记物为荧光染料标记物为荧光染料激光扫描自动测序激光扫描自动测序激光扫描自动测序激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高结果清晰、准确、分辨率高测序速度快测序速度快测序速度快测序速度快 200bp/h 200bp/h剿认蹭瑶载豌姿略趾咐店慑褂赶嫂夫样拢矢鹏厘国你衔朴党阻秤畜貉牧绢第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定 DNA自动测序与手工测序的不同点自动测序与手工测序的不同点1 1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用序采用序采用序采用4 4种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记种荧光染料分别标记ddNTPddNTP或标记引物或标记引物或标记引物或标记引物2 2、加样方式不同：手工测序，一个样品的、加样方式不同：手工测序，一个样品的、加样方式不同：手工测序，一个样品的、加样方式不同：手工测序，一个样品的4 4个测序反应物分个测序反应物分个测序反应物分个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳3 3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4 4种寡聚核种寡聚核种寡聚核种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出苷酸的梯子形图谱中读出苷酸的梯子形图谱中读出苷酸的梯子形图谱中读出DNADNA序列，而自动测序则采用序列，而自动测序则采用序列，而自动测序则采用序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑莉谣笆愉途涨赔赣湾摘筑婴姻龟注咖救戚焰芦是逻余矮输坞抗移钻帆釜体第九章DNA序列测定第九章DNA序列测定。