噬菌体展示技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主讲：叶思灵,噬菌体展示技术,什么是噬菌体展示 是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的,DNA,则位于病毒粒子内表型,基因型,展示肽,编码基因,使大量多肽与其,DNA,编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定,简介,Landmarks of phage display,1985,第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽,Smith GP.Science.1985;228:1315-7,1988,噬菌质粒系统,1990,抗体片段的展示,1993,展示,cDNA,文库,1994/1995,研发了,phage two-hybrid,技术,1996,首次体内,in vivo,淘选试验,1998,噬菌体展示载体作为基因导入载体,1999 Combination of phage display with high-density arrays,2001 Automated phage display selection,Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines,Published:3 April 2008,BMC Biotechnology,2008,8,:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37,展示系统,Display System,Cell Based,1,、,Phage Display,2,、,Cell Surface Display,Cell Free,1,、,Ribosome Display,2,、,mRNA Display,噬菌体展示系统的分类,根据噬菌体不同,Phage,M13,f1,fdT7,T4,lamda,根据载体不同,Vector,True Phage Phagemid,根据文库不同Library,随机肽库,、,cDNA,文库,、,抗体文库,、,蛋白质文库,M13,噬菌体的组成和结构,丝状噬菌体：,M13,、,f1,和,fd,。

单链,DNA,病毒,6407 bp,基因组编码,11,种蛋白质，其中,5,种为结构蛋白质与展示密切相关的有两种结构蛋白质DNA,在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒,Life Cycle of M13,pIII,蛋白结合于,E.Coli,的,F,纤毛,;,病毒,ssDNA,进入细菌的胞浆合成,dsDNA,；,以,dsDNA,为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的,ssDNA,第一代噬菌体在感染,10,分钟后出现在培养液中（,37,）感染后,1,小时内平均每个细胞分泌,1000,个噬菌体次要衣壳蛋白,pIII,406 aa,组成，,5,个拷贝，位于噬菌体的尾部由三个功能区组成：,N1,穿膜区：作用于,E.coli,细胞膜上的,TolA,蛋白；与噬菌体的入侵有关N2,受体结合区：负责结合,F,菌毛CT,疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关G1,、,G2:,甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性主要衣壳蛋白,pVIII,每个病毒子含约,2700,个拷贝，约,10%,能有效地融合外源多肽或蛋白以,pIII,融合子方式表达的多肽是低价的，而以,pVIII,融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子,200,个拷贝）。

这种高价,pVIII,展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价,pIII,展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上所有,Ph.D.,文库都是,pIII,融合方式（每个病毒子展示,5,个拷贝的外源多肽）pIII,蛋白展示和,pVIII,蛋白展示有什么不同,?,pVIII,展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装pIII,只要不影响感染，可以展示,300 aa,的多肽噬菌质粒能展示的蛋白已经达到,86 kDa,丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白,pIII,或,pVIII,的,N,端融合外源多肽每个病毒子含个拷贝的,pIII,蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力拷贝数不同噬菌体质粒,方便克隆、增强遗传稳定性,噬菌体质粒特征：,携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因有质粒复制起点,(322 ori),和噬菌体复制起点,(f1 ori,用于合成,ssDNA),有包装序列信号（,packing signal,）有供筛选的抗生素标记基因Helper phage,：提供噬菌体质粒复制、合成,ssDNA,和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（,f1 oridefect),。

噬菌体展示技术流程,淘选的方法亲和淘选,直接包被法淘选法：,优点：简单直接缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入,可能是由于分子的立体封阻,或者是靶分子表面的部分变性而引起,液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体,-,靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面建库：,例子,含编码,12,肽,DNA,序列为,5,CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC,T(NNK),12,GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3,，其中,N,代表,A,、,T,、,C,、,G,四种碱基，,K,代表,G,、,T,两种碱基，,(NNK)12,为编码随机,12,肽部分，划线部分含有,Bgl,识别序列扩增,-,嵌合,-,噬菌体扩增,亲和淘选,噬菌体肽库与靶分子相互作用,洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体,将特异性结合的噬菌体洗脱下来,三轮淘选后，克隆测序,噬菌体展示的应用,抗原表位分析,制备特异性抗体,制备疫苗、多价疫苗,构建新型的生物催化剂,如,Renet al(1997),将,T4 DNA,连接酶展示于,T4,噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端。

有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造,superenzyme,筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具Dennis,从肽库中筛选到非竞争性地抑制,F VIIa,活性的肽段噬菌体展示的应用,蛋白质蛋白质相互作用,噬菌体,cDNA,文库与芯片相结合,(a),合成噬菌体,cDNA,文库b),生物淘选c),铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备噬菌体展示的应用,应用举例,用病人,IgE,血清对,6,种不同的,cDNA,文库淘选，,5,轮后，挑出,38,000,个克隆，鉴别了,233,种蛋白，其中,47,种为已知，,186,种是新的过敏源烟曲霉,(Aspergillus fumigatus),已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌草本枝孢,(,小麦黑霉病菌,)Cladosporium herbarum,鸡腿蘑（,Coprinus comatus,）,皮屑牙胞菌,(Malassezia furfur),花生和人肺组织,Crameri,R.,et al.,(2001)Tapping allergen repertoires by advanced,cloning technologies.,Int.Arch.Allergy Immunol.,124,4347,噬菌体表面展示肽库优缺点,优点：,M13,无需体外包装,电转化效率高,库容量大,2.8,10,9,M13,噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程,可避免细胞蛋白的污染,Any ligand(natural or synthetic),随机肽库,体内筛选器官特异性多肽,缺点：,仅适合展示小的多肽,(,=20,氨基酸,),载体容量,1 kb,；且有序列依赖性,不能筛选,Natural ligand(T7 cDNA,文库,),不能筛选,DNA-,RNA-,结合肽,(,用,T7,载体文库可以,),THANS！,Elements,。