蛭弧菌的研究进展.doc

我国对噬菌蛭弧菌的研究中国医学细菌中心弧菌噬菌体研究室秦生巨细菌的寄生菌为Stolp和Petzold 1962年首次在徳国的土壤中于一种植物假单胞菌上发 现的1963年Stolp和Starr又在美国加利福尼亚州的土壤、污水中用独特的分离技术得到 了这类细菌，并命名为Bdellovibrio bacteriovorus （噬菌蛭弧菌，简称蛭弧菌）因发现这 类细菌，Stolp等曾被授予Koch奖金由于此类菌对宿主菌的''寄生''和''裂解〃的生物特性引 起了人们极大的兴趣，20多年来，美国、苏联、日本、以色列、法国、加拿大和印度等许多国 家的实验室都在进行对这类菌的研究蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌它广 泛存在于自然水体、污水及土壤中，也可以从动物或人体内粪便中检出蛭弧菌可裂解不同科 属的多种细菌，如沙门杆菌、不凝集弧菌、副溶血弧菌和一些植物致病菌，如白菜软腐病菌、 水稻白叶枯病菌等蛭弧菌的宿主范围不仅局限于革兰阴性菌，对革兰阳性菌同样有裂解作 用近年来许多研究均己证实蛭弧菌是环境水体自然净化的极为重要的生物因子之一目前国 外许多实验室也在探索利用蛭弧菌净化自然河水、污水中的细菌以及动植物致病菌的清除。

1979年我们在国内开展蛭弧菌的研究，1982年我国首次发现并及时报道了蛭弧菌的研究 10多年来对此类菌的培养特性、生态学、生物学、生理学特性及培养物的保存等作了系统的研 究并发现我们分离的蛭弧菌株对许多肠道致病菌，如霍乱弧菌、不凝集弧菌、副溶血弧菌、 福氏志贺菌及大肠杆菌等均有显著的裂解作用因此我们乂着手探索利用輕弧菌对极易污染肠 道致病菌的自然环境水体的生物净化1985年以來先后进行了在实验条件、模拟自然条件和 自然条件河、湖水中对E/FO厂霍乱弧菌、不凝集弧菌、大肠杆菌、志贺菌、大肠菌群等净化作 用的研究，结果发现蛭弧菌在不同的水体中对许多细菌均有不同程度的清除作用1983年以 后刘秉阳等也相继开展了对此类菌的研究这些研究为利用蛭弧菌净化自然水体中的霍乱弧 菌、伤寒沙门杆菌、不凝集弧菌等肠道致病菌提供了重要的科学依据，而且有极其广泛的应用 价值，从而在预防国内常见的肠道传染病方面，在净化自然水体及环境水源保护方面，将产生 重大的社会效益和经济效益一、蛭弧菌生物学特性的研究（一） 蛭弧菌的检查、分离我们在对蛭弧菌分布调查的基础上分离、纯化了 254株蛭弧菌，并对英中一些菌株做了进 一步研究。

蛭弧菌不能利用环境提供的营养而生长，必须在宿主菌细胞内或其抽提物中才能生 长、发育、繁殖，最后使宿主菌裂解所以，蛭弧菌是一类细胞内的寄生菌除非菌株发生突 变后，可成为腐生或兼性寄生菌，才能利用人工培养基生长因此在琼脂平板上检查蛭弧菌噬 斑，必须用生理盐水洗涤、离心除去携带培养基成分的浓厚的宿主菌（400亿/ml以上）悬液 制备琼脂平板由于琼脂平板中儿乎没有可供牛长的营养，所以宿主菌在此平板上儿乎不牛 长，或牛长相当缓慢，而冃.浓厚的菌体使琼脂平板成为半透明状态蛭弧菌接种在此琼脂平板 中，感染了宿主菌，在其生长增殖并使其裂解，再感染周圉的宿主菌使其裂解，如此逐渐扩 大，就形成了一个无菌的透明区，称为蛭弧菌噬菌斑二） 蛭弧菌培养基的选择蛭弧菌在灭菌自来水、灭菌海水、灭菌蒸馆水、酵母膏■陈液（YP）、酵母膏■胰腺液（LB） , Tris无机盐缓冲液及1/10、1/5腺・肉膏液制成的琼脂平板上均可形成噬菌斑作者 采用灭菌自来水制备琼脂平板；在液体中培养蛭弧菌也采用灭菌自来水，蛭弧菌发育良好，操 作也极为方便，并可节省大量的人力、物力和财力，比较了双层琼脂、双层琼脂夹心、单层琼 脂和琼脂平板表面法检查蛭弧菌噬斑。

双层琼脂平板噬斑发育良好，分布均匀，不易干燥，适 当封闭后标木还可以长期保存，操作也很简便易行，为我国蛭弧菌研究工作中首先选用的方 法三） 蛭弧菌的培养特性蛭弧菌的噬斑透明，无菌落形成蛭弧菌的不同菌株其噬菌斑的形态、大小也不同，大的直 径可超过15 mm ,小的直径只约0.5 mm （48h）,而且可随培养时间的延长而扩展用双 层琼脂平板培养得到的蛭弧菌噬斑与噬菌体噬菌斑极为相似，但以同样的培养基（自來水）和 方法（洗涤的菌悬液为宿主）检查噬菌体不能见到的噬菌斑我们曾试以E/Tor霍乱弧菌噬菌 体、福氏志贺噬菌体、大肠杆菌体及绿脓杆菌噬菌体检查，均不能检出噬菌斑用检査噬菌体 的方法及培养基检查蛭弧菌同样不能见到噬菌斑蛭弧菌及噬菌体均培养于4 °C环境中，分 离的大多数蛭弧菌仍可出现噬菌斑，但噬菌体虽于腺■肉膏营养琼脂上也不会出现噬菌斑在液体中培养、增殖蛭弧菌，蛭弧菌能侵染、裂解宿主菌，3-5d使浓厚的宿主菌悬液裂 解、澄清，蛭弧菌的数目增加但是用这种方法增殖蛭弧菌，很难得到高效价的蛭弧菌培养 物，即使在澄清的蛭弧菌培养液中反复的补充宿主菌，也不能达到高效价的增殖蛭弧菌的冃 的，原因尚不清楚，有待进一步研究。

四）蛙弧菌的形态结构蛭弧菌噬菌斑革兰染色高倍镜观察，可见典型的、多量的革兰阳性、小的弧或杆状细胞蛭 弧菌噬菌斑悬滴相差显微镜下可见到运动极其活泼，呈跳跃式积极追捕宿主的蛭弧菌细胞，在 相差显微镜下可以连续观察蛭弧菌吸附、侵染，进入、增殖、牛长、裂解宿主细胞的全过程电子显微镜负染透射镜观察，可见到弧状或杆状蛭弧菌细胞，细胞一端有一长的单鞭毛（图 1） o述可见到蛭弧菌吸附在宿主菌细胞上的典型形态（图2）图1蛭弧菌的端生鞭毛 图2蛭弧菌吸附于宿主菌的情况噬菌蛙弧菌Bd39电镜照片（X24920） 下端为宿主福氏志贺菌，上端为Bd76（X19780）我们观察了 12株蛭弧菌的形态，结果发现不同蛭弧菌的细胞人小有所弟别，同株的细胞人小 也有差异蛭弧菌细胞的大小，一般为长0.8.1.4pm,宽0.3~0.5pm之间超薄切片电镜观 察，可见到蛙弧菌在细胞内生长、繁殖的结构（图3） o图3蛭弧菌与宿主菌的相互作用（五）pH对蛭弧菌噬菌斑形成的影响我们观察了于不同pH自来水宿主双层琼脂平板上检查蛭弧菌（Bd81, Bd98）形成噬菌斑 的能力，结果表明pH对蛭弧菌生长及噬菌斑形成有明显的影响，虽然pH在3.0.9.8的自来 水宿主菌双层琼脂平板上均可形成噬菌斑，而pH7・0~7・6最为适宜。

pH在5.5或以下， pH9・0或以上，噬菌斑数目约减少一半•但蛭弧菌的生物特性不发生改变呼兰等从人粪便分离获得的蛭弧菌BdC、BdE、BdL、BdW最适pH为7.0, pH9.0不能 形成噬菌斑，其原因有待进一步检查六）温度对蛭弧菌的影响1. 温度对蛭弧菌噬菌斑形成的影响不同蛭弧菌株形成噬菌斑的最适宜温度并不完全相同我们观察了来自海水、海泥、河水、 河泥、湖水、污水和人粪便中分离得到的262株蛭弧菌在4, 10, 15, 20, 25, 30, 37°C 环境中形成噬菌斑的能力，发现20-30°C时对大多数菌株的噬菌斑形成更为适宜少数菌株（Bd59） 37°C更为适宜人粪便中分离的蛭弧菌也是以37°C最为适宜在4°C冰箱中也能形 成噬菌斑，但需较长时间（如12D以上）近來研究发现，极少数菌株可诱导至43°C中生 长为利用蛭弧菌制剂预防动物肠道细菌病提供了依据2. 温度对蛭弧菌生长增殖的影响秦生巨等报道，在灭菌自来水中加入适当比例的蛭弧菌和宿主福氏志贺菌，分别于4, 10, 15, 20, 25, 30和37°C及室温（7°C±2°C）水浴中培养，每隔24h取样一次，以自 来水宿主双层琼脂平板法检查蛭弧菌生长繁殖的数日。

从自来水宿主双层琼脂平板中蛭弧菌形 成噬菌斑数目来看，蛭弧菌生氏繁殖的最为适宜温度为25°C,温度较高，如37°C时蛭弧菌数 目反而逐渐减少，并失去活力但于4°C冰箱中可继续生存，培养至第4天增殖数量为最高， 此后反而减少，原因有待进一步研究，或可能因为宿主减少，蛭弧菌没有赖以繁殖的宿主3. 温度对蛭弧菌活力的影响研究中发现蛭弧菌培养物不耐热，如蛭弧菌Bd81、Bd98, 15~25°C以上时乃呈渐渐失活 的现象，如以25°C时，蛭弧菌的活存数冃为100%,则15~20°C时呈较为稳定状态，存活数 分别为94・9%~100%（Bd81）； 30, 35, 40, 45及50°C是时存活率依次为78.0%, 62.7%, 40.7%, 30.5%和 0%4. 温度对蛭弧菌净化河水的影响蛭弧菌在污水自净过程中参与作用的研究结果证明，蛭弧菌裂解作用可降低污水中异养性革 兰阴性杆菌及大肠杆菌的数量这种裂解活性明显地受温度影响，因为温度可影响寄生菌与宿 主菌之间相互作用的速度，在水温为26°C时寄生物/宿主（P/H）的指数最大，而在19°C时最 小当污水在26°C净化吋，沉淀池污水中含大肠杆菌为800CFU/ml,而在19°C净化水时含 大肠杆菌为4000 CFU/ml,污水中相互作用的微生物数量发生变化，这是典型的P/H的关 系。

这些研究结果证明，在污水自净过程中，蛭弧菌在26°C环境河水中可以有效地参与清除肠 道微生物群，而在23.5°C时清除率低，在19°C环境河水中蛭弧菌不能实现对其污水净化作用 另据报道,蛭弧菌Bd81和Bd98在25°C的湖水中对宿主福氏志贺菌有显著的清除作用，如 7d时,福氏志贺菌可被清除92.8% （Bd81）和94.4% （Bd98）不加蛭弧菌的对照仅减 少20%,统计学有非常显著性差异（P<0.01） o（七）蛭弧菌在死的宿主菌中的生长特性蛭弧菌Bd81、Bd98于加热及氯仿处理失活的宿主菌双层琼脂平板上可比在未经处理的活 的宿主菌双层琼脂平板上更迅速的形成噬菌斑，后者一般需40~48h才可出现噬菌斑在加热 及氯仿处理的宿主菌双层琼脂平板上只需14h,形成噬菌斑的数日也大大增多例如在100°C 加热致死的宿主菌中Bd81增加105倍，Bd98增加约72倍，在80°C加热致死的宿主菌中 Bd81增加151倍，Bd98增加73氯仿处理致死的宿主菌上Bd81增加74倍，Bd98增加 67倍在这些宿主菌的琼脂平板中形成的噬菌斑也明显的小于在活菌平板上，形成噬菌斑的时 间也较快（Bd81为28h, Bd98为36h）,数量也有增加（Bd98）或没有增加。

在抗生素 （氯霉素、土霉素、氨节青霉素及多粘菌素B）处理失活的宿主菌双层琼脂平板上，形成噬菌 斑的时间差别不大，噬斑的数量与在活菌宿主菌双层琼脂上也不增加（Bd81）或差别不大（Bd98） o检查了 Bd81、Bd98于100°C热死宿主菌自来水培养液中生长增殖的情况分别在活的及 加热致死的宿主菌双层琼脂平板上计数噬菌斑，用活的宿主菌双层琼脂平板检查，试验组第2 天（48h）蛭弧菌Bd81噬斑增加到l.lxlO4PFU/ml，对照组增加至8.4xl03 PFU/ml，第 五天两组均达到最高，试验组为LlxlO^PFU/ml,对照组为6.0X104 PFU/ml,试验组为对照组 的183.7%o同样，Bd98在48h试验组噬菌斑增加至6.3xlO4PFU/ml,对照组为 6.7xlO3PFU/ml,第五天试验组增至9.0xl04PFU/m,对照组为4.9x 104PFU/ml,前者 为后者的183.7%0如培养后蛭弧菌以加热致死的宿主菌欢层琼脂平板计数噬菌斑，培养48h 后，试验组Bd81为3・4xl06pFU/ml,对照组为4.OxlO5PFU/ml ,第五天试验组为 8.0xl06PFU/ml,对照组为8.0xl05PFU/ml,前者为后者的10倍。

Bd98试验组48h后 噬菌斑为2.1xlO7PFU/ml,对照组为8.0xl04PFU/ml,第五天试验组为2.4xlO7PFU/m I,对照组为2.3xlO5PFU/ml,前者为后者的10.4倍实验结果证明，在加热致死的宿主菌上生长增殖的蛭弧。