北京培训中心两虫全流程.ppt

水中隐孢子虫和贾第虫的检测爱德士培训中心Sep 27,20131流 程选 择回收率 2两虫检测全流程•样品预处理（Sample Pretreatment）. •染色镜检（Staining and Microscopy）. •免疫磁分离（IMS）. 过滤. 淘洗. 离心. 3样品预处理——过滤加标实验（QC） 10L  采样量4样品预处理——过滤5样品预处理——过滤 滤芯结构过滤时水流流向淘洗时水流流向• 79层多孔网状泡沫层，两种规格交互叠放，由790mm压缩至30mm，螺栓固定•滤芯两个过滤层：外层区域为初滤器，内层滤核为选择性滤器（此结构在提高污水样品过滤速度的同时，保证有效地捕获隐孢子虫卵）•淘洗时，目标微生物以反流的形式更方便地进行有效淘洗•可处理高浊度原水 •取样流速可达4L/min6样品预处理——过滤 实验室过滤7样品预处理——过滤 现场过滤8样品预处理——过滤 现场过滤——两虫移动取样箱9样品预处理——过滤ü 滤器ü 滤芯ü 采样管ü 水表ü 保温袋ü 自封袋 现场过滤——两虫移动取样箱10样品预处理——过滤•根据客户需要合理设计的取样箱。

•解决现场采样问题，并使得现场采样操作简便 •解决部分无两虫检测设备的送样问题 现场过滤——两虫移动取样箱11样品预处理——过滤 现场过滤12样品预处理——过滤 现场过滤13样品预处理——淘洗 Filta-Max Xpress两虫快速法淘洗设备•稳定的高回收率（大于70%）•淘洗时间90s，目前全球淘洗速度最快的设备•一键操作，操作简单 •不同样品的结果一致性高，性能稳定14样品预处理——离心•离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动•离心管连同适配器一起配平，保证误差在0.5g以内，尽量减少摆动•离心机设定2000g离心力，工作时间15分钟•离心机应选用无刹车系统的（自然停止大约需7分钟） 15免疫磁分离•基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外磁场中，复合物被吸附而滞留在磁场中，使其与其他物质分离  定义16免疫磁分离17免疫磁分离18免疫磁分离 试剂盒19免疫磁分离样品量：0.5-0.8ml沉淀混匀时间：1-2小时依次取下L型试管90°旋转2分钟弃上清1XbufferA冲洗磁珠180°旋转1分钟弃上清后酸化分离 实验流程20免疫磁分离 沉淀物体积•对于沉淀量小于0.5mL的样品，直接再悬浮成10mL.•对于沉淀量大于0.5mL的样品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀悬浮成10mL。

比如，2mL沉淀应该悬浮成40mL，具体免疫磁分离过程可以取其中一分部进行•根据经验，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L处理水的沉淀量一般小于0.5mL21免疫磁分离 结果计算•如出厂水检测出3个隐孢子虫，带入共计进行计算： Y=（3×10mL)/(10mL×100L)=0.03个/L•如原水沉淀量2mL，悬浮成40mL，免疫磁分离取了其中10mL，检出3个隐孢子虫，带入并计算： Y=（3×40mL)/(10mL×20L)=0.6个/L22染色镜检 染色试剂盒•单克隆荧光抗体染色试剂•复染液•封固剂•DAPI染色试剂•阳参•1倍洗脱缓冲液23染色镜检 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)•分子量为389.4，最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长为525~530nm，呈现明亮的黄绿色荧光•FITC是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质，例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记•能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。

•通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测•储存条件：4℃避光保存24染色镜检 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)•一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色•在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色•能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序25染色镜检 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)浓度2mg/mL，用时需要5000倍稀释，现用现配26染色镜检 镜检27染色镜检 两虫孢囊与卵囊特征——贾第虫孢囊•外形：卵形或椭圆形•直径：11-14um28染色镜检 两虫孢囊与卵囊特征——隐孢子虫卵囊•外形：类似球•直径：4-6um29染色镜检 两虫孢囊与卵囊特征•苹果绿外壳：充要条件•大小和形状30染色镜检FITC染色DAPI染色DIC观察31染色镜检32染色镜检33染色镜检34如何提高回收率 采用商售PBS淘洗液试剂品牌货号PBSSigmaP4417-50TABNaOHFluka38215-1EA-RHClFluka35335-1LTween20SigmaP7949-100ML35如何提高回收率 采用商售HCL和NaOH试剂，或标配所需酸碱36如何提高回收率 对容器和管子进行润洗•使用0.05%的吐温20或者吐温80，对于样品接触的所有容器都进行润洗，将润洗的液体也加入样品。

37如何提高回收率 离心后，谨慎去除上清液•可采取虹吸，弃去上清管子上插上枪头，使得震动最小38如何提高回收率 谨慎清洗玻片•隐孢子虫和贾第虫可能在染色过程被冲走，为了避免此情况发生，请轻轻的移走玻片上的液体39如何提高回收率 玻片干燥过程可影响回收率•IMS过程中的酸如果没有有效中和可以破坏贾第虫的孢囊外表，引起贾第虫染色过程中的变化这可以导致镜检过程中贾第虫的漏检快速将样品干燥以及冷藏样品可以保证贾第虫的表面不受损坏 •为了优化此步骤，确保样品一旦中和后，快速在37℃条件下干燥（最长干燥时间1小时），并立即染色•如果IMS中和后需要延迟染色，需要快速在37℃干燥玻片后立即放入冰箱冷藏过夜否则，需要在标准的家用冰箱冷藏过夜在冷室中干燥玻片可能由于湿度环境使得玻片不易干燥40如何提高回收率 免疫磁分离•对于一些水样，很大一部分的隐孢子虫和贾第虫可能会遗漏在IMS磁珠上，在酸化过程中没有得到回收此时进行二次酸化可以有效提高回收率IMS分离过程中，二次酸化分离非常有用•对于回收率比较低没有满足回收率标准的样品，可以将其IMS过程废弃的上清液进行收集，对这些废液再次进行免疫磁分离过程，以满足回收率。

可以将废液收集到免疫磁分离之前用的 50mL的离心管中，这可以避免错误的标记样品，你可以分辨哪个样品具有较低的回收率然后做一个二次的免疫磁分离非常多的干扰免疫磁分离的物质在第一次免疫磁分离过程中都被去除掉了，所以第二轮免疫磁分离回收率可能会戏剧性的更高41如何提高回收率 可中断的过程及保存时间样品分析步骤样品分析步骤最大允许中断时间最大允许中断时间样品采集、过滤72小时淘洗一个工作日离心免疫磁分离转移至载玻片样品干燥72小时染色镜检7天（但需封片保存，并放置在避光处）42Tel: 400 678 6682: 2352089854Thanks for your attention!谢谢！43。