木聚糖酶检测方法.docx

本文格式为Word版，下载可任意编辑木聚糖酶检测方法 木聚糖酶活力的测定 分光光度法 1 原理 木聚糖酶能将底物木聚糖（本测验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有恢复性末端的寡糖和有恢复基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色回响回响液颜色的深浅与酶解产生的恢复糖量成正比，而恢复糖的生成量又与回响液中木聚糖酶的活力成正比因此，通过分光比色测定回响液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力 2 木聚糖酶活力单位（U）的定义 在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol恢复糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）其中样品的酶活力以 U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示 桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood） 3 主要仪器 3.1 分光光度计 3.2 细致电子天平 精确至0.0001 g 3.3 恒温水浴锅 30-60℃可调，精度为0.1℃。

3.4 酸度计 精确至0.01 3.5 秒表 每小时误差不超过5s 3.6 刻度试管（15mL） 带玻璃塞，10支以上 3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL） 3.8 分样筛 孔径为0.25 mm（60目） 3.9 分析天平 精确至0.001 g 3.10 磁力搅拌器 附加热功能 3.11 电磁振荡器 3.12 烧结玻璃过滤器 孔径为0.45 μm 3.13 离心机 3000 r/min 3.14 冰箱 4 试剂与溶液配制 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水 4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L） 称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL 4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L） 吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL 4.3 乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1 mol/L） 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL 4.4 乙酸——乙酸钠（CH3COOH — CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1 mol/L，pH为5.0） 称取三水乙酸钠19.17 g，参与冰乙酸3.60 mL。

再加水溶解，定容至2000 mL测定溶液的pH值假设pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调理至5.0用细致pH试纸检定 4.5 木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0 mg/mL） 称取无水木糖1.000 g，加乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 mL 4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/L） 称取木聚糖（Sigma X0627）1.00 g，参与0.32g氢氧化钠，再参与90 mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解然后中断加热，持续搅拌30 min，参与0.8 mL冰乙酸持续磁力搅拌，测定其pH值假设pH值为5.0，用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL假设pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调理至5.0， 然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL木聚糖溶液能立刻使用，使用前适当摇匀4℃避光保存，有效期为3天 4.7 DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g（化学纯），加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45℃然后逐步参与100 mL氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈通明（留神：在参与氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。

再逐步参与四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g持续45℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到参与的物质完全溶解中断加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL用烧结玻璃过滤器过滤取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月 4.8 乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液 量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液，参与0.15gTriton X-100（曲拉通100），0.15g牛血清白蛋白（BSA）混合平匀假设pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调理至5.0 5 标准曲线的绘制 吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0 mL，参与DNS试剂（4.7）3.0 mL，沸水浴加热5 min用自来水冷却至室温，用水定容至15.0 mL，制成标准空白样 分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL，分别用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL，配制成浓度为300、400、500、600、700、800 μg/mL木糖标准溶液 木糖系列浓度150 (μg/mL) 200 250 300 350 400 分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00 mL（做三个平行），分别参与到刻度试管中，再分别参与1.0 mL缓冲液（4.4）（终浓度分别为：0,150，200，250，300，350和400μg/mL）和3.0 mL DNS试剂（4.7）。

振荡3 s，沸水浴加热5 min然后用自来水冷却到室温，再用蒸馏水定容至15 mL以标准空白样为对照调零，在540 nm处测定吸光度OD值 以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线每次新配制DNS试剂均需要重新 表一：木糖标准曲线制作数据记录 1号管 2号管 OD540nm 3号管 平均 用EXCEL 线性回归，得到回归方程，用于后续酶活力的计算： y(μg/mL)=a·OD540nm + b --------------------------------------------------（2） 得： a= ； b= . 6 试样溶液的制备 固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25 mm），称取1.000g样品，精确至0.001 g参与40 mL乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）高速磁力搅拌30 min，再用缓冲溶液（4.4）定容至100 mL上离心机（3.13）4000r离心3min，取上清液，再用缓冲溶液（4.4）做适当稀释（吸光度OD540nm值应操纵在0.2-0.6之间，否那么需重新稀释再做）。

（注：当以麸皮或玉米芯份做载体的样品时，应使用乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液（4.8）抽提，但应使用乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液（4.4）稀释 液体样品可以直接用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）举行稀释、定容（稀释后吸光度在0.2-0.6之间）假设稀释后酶液的pH值偏离5.0，需要用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调理校正至5.0，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容 7 测定步骤 吸取10.0 mL木聚糖溶液（5.6），40℃平衡10 min 吸取10.0 mL经过适当稀释的酶液，40℃平衡10 min 酶空白样制作： 吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），参与到刻度试管中，再参与3mL DNS试剂（4.7），电磁振荡3 s然后参与1.0 mL木聚糖溶液（4.6），40℃回响20 min，沸 水浴加热5 min用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s以此作为回响空白调零 酶回响样制作（需作3个平行）： 吸取1.00 mL经过适当稀释的酶液（已经过40℃平衡），参与到刻度试管中，再参与1.0 mL木聚糖（4.6）（已经过40℃平衡），电磁振荡3 s，40℃精确保温20 min。

参与3.0 mL DNS试剂（4.7），电磁振荡3 s，以终止酶解回响沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至15 mL，电磁振荡3 s以酶空白样为调零，在540 nm处测定吸光度A跟据回归方程计算出恢复糖量，即y值 8 试样酶活的计算 Y × N × 2 XD = ------------------------（2） 20 × 150 XD — 试样稀释液中木聚糖酶的活力，U/mL或者U/g； Y — 根据样品吸光度OD540nm，用回归方程计算出的恢复糖量（即y值），单位为：μg/mL； N — 从固体样品到测定前最终液的总稀释倍数； 2 — 酶促回响体积为2.0 mL 150 —木糖分子量，转化为μmol； 20 — 酶解回响效时间20,min； 酶活力的计算值留存三位有数字 表二：样品活力测定结果数据记录 木聚糖酶活力 酶样 OD540nm （U/g酶样） 样品1 样品2 样品3 平均 注：由公式2的回归方程求出结果。

9 重复性 每个试样应取二份平行样举行分析测定，相对误差不超过8.0%，二者的平均值为最终的酶活力测定值（留存三位有效数字） — 7 —。