【最新word论文】Doxycycline抑制人肝癌细胞系HepG2生长的实验研究【临床医学专业论文】.doc

1Doxycycline 抑制人肝癌细胞系 HepG2 生长的实验研究作者：张强波　李杰　时昌文　李捷　孙京杰　曹莉莉 【摘要】 目的：观察多西环素（Doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系HepG2 生长抑制和凋亡的作用，并初步探讨其作用机制方法：不同浓度的Doxycycline（5、10、20、30 和 50 mg/L）对体外培养人肝癌细胞系 HepG2 进行不同的时间干预（24、48 和 72 h） ，MTT 法测定细胞生长抑制率，TUNEL 法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测 Fas、FasL 及 MMP-2 蛋白表达的变化结果：Doxycycline 作用 HepG2 细胞 48 h 和 72 h 后，细胞生长被明显抑制，与无药对照组比较差异有统计学意义（P<0.001） ，且呈时间、浓度依赖趋势其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（P<0.01） ；20 mg/L Doxycycline 作用于癌细胞 48 h 后，实验组 FasL 蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，MMP-2 蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差异均有统计学意义（P<0.01） ，而 Fas蛋白表达则差异无统计学意义（P>0.05） 。

结论：Doxycycline 对人肝癌细胞系 HepG2 具有明显的生长抑制和促凋亡作用，其机制可能与下调 MMP-2、上调FasL 从而启动 Fas/FasL 膜受体途径有关 【关键词】 肝肿瘤·Doxycycline·细胞凋亡·FasL·MMP-2【ABSTRACT】Objective: To observe the effect and mechanism of doxycycline on cell growth inhibition and the apoptosis of human hepatoma cell HepG2 in vitro. Methods: HepG2 cells were treated with doxycycline at different concentrations and time in vitro. Cell growth inhibition rate was detected by MTT assay, and apoptosis rate was identified by TUNEL assay, the expression of Fas, FasL and MMP-2 proteins were examined by immunocytochemical staining. Results: Treated with doxycycline at different concentrations （5，10，20，30 and 50 mg·L-1） for 48 and 72 hours, the growth of HepG2 cells decreased significantly （P<0.001） and there was a tendency of dose-time dependent manner. Incubated HepG2 cells with doxycycline at 20 mg·L-1 for 48 hours, the expression of FasL were up-regulated and MMP-2 were down-regulated compared with those of control group （P<0.01）, while the difference of Fas expression was insignificant （P>0.05）. Conclusion: Doxycycline might inhibit cell growth and induce apoptosis of HepG2 significantly. The mechanism of doxycycline induced apoptosis might be associ多西环素（Doxycycline）为四环素类抗生素的一种，已有研究表明其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤生长有明显的抑制作用［1-3］ ，而其对人2肝癌细胞的生长抑制作用国内外未见报道。

本研究观察了 Doxycycline 对人肝癌细胞系 HepG2 的生长抑制和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制1　材料与方法1.1　实验材料　人肝细胞性肝癌细胞系 HepG2 购自美国典型物保藏中心细胞库，用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基，37℃、5%CO2 饱和湿度的孵箱内常规培养，每日倒置显微镜观察细胞生长情况，3d 换液，适时 0.25%胰酶消化传代四甲基偶氮唑盐（MTT） 、DMSO 和 Doxycycline 均购自 Sigma 公司，TUNEL 凋亡检测试剂盒购自 Roche 公司，FasL 兔多克隆抗体及 MMP-2 鼠单克隆抗体购自SANTCRUZ 公司，Fas 鼠单克隆抗体购自北京中山公司1.2　方法1.2.1　MTT 法检测肿瘤细胞生长能力　取对数生长期 HepG2 细胞，配成1.5×105 mL-1 的单细胞悬液，96 孔培养板每孔加入 200 μL 细胞悬液约3×104 细胞，细胞常规培养 4 h，贴壁后每孔重新加入含不同浓度 Doxycycline的培养液 2 μL，使其终质量浓度约分别为 5、10、20、30 和 50 mg/L，每个药物浓度设 5 个孔。

同时设无药对照组 5 孔，无细胞培养液 1 孔（调零孔） 37℃、5%CO2 饱和湿度的孵箱内常规培养 24、48 和 72 h，分别取培养板 MTT 法计算药物作用后的吸光度（optical density,OD） 按以下公式计算细胞生长抑制率：1.2.2　TUNEL 检测细胞凋亡　取对数生长期生长良好的 HepG2 细胞，将其分别接种于 200 mL 培养瓶中，细胞贴壁后更换成含终质量浓度分别为 5mg/L 和20 mg/L Doxycycline 的条件培养液作用 24、48 和 72 h胰酶消化各组细胞后，取 1 滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁生长 4 h 制成细胞爬片，用 1∶1甲醇丙酮固定 30 min,保存备用按 TUNEL 试剂说明书（Roche）操作，采用倒置荧光显微镜成像，随机选取 5 个视野 300 个细胞计算细胞凋亡率1.2.3　细胞免疫组织化学法检测 FasL、Fas 及 MMP-2 蛋白的表达　应用前述方法制作细胞爬片，分别加入 FasL、Fas 及 MMP-2 一抗，用 SABC 法进行细胞免疫组织化学染色，DAB 显色1.3　判断标准　FasL、Fas 及 MMP-2 蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反应为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。

免疫组织化学结果判定参照文献［4］ ，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量分析随机观察 5 个高倍视野，根据阳性细胞数占细胞总数的百分比计为 0～4 分：无阳性细胞为 0 分，<25％为 1 分，26％～50％为 2 分，51％～75％为 3 分，>75％为 4 分；染色的深度以多数细胞的显色反应为准，着色强度计 0～4 分：无色为 0 分，淡黄色为 1 分，深黄色为 2 分，棕黄色为 3 分，棕褐色为 4 分将上述两项指标的评分相加每张片分别由 2 个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值1.4　统计学处理　使用 SPSS11.0 统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析或独立样本 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义 2　结果32.1　Doxycycline 对 HepG2 细胞生长的抑制作用不同浓度 Doxycycline 作用于 HepG2 细胞 24、48 和 72 h 后，各组 OD 值见表 1，其中 24 h 各实验组 OD值与对照组相比差异无统计学意义（F=1.15,μ>0.05） ，48h 和 72 h 组较对照组均出现了不同程度的生长抑制作用（F=102.9,F=176.7;P<0. 01） ，并呈明显的时间和浓度依赖性（图 1） 。

2.2　Doxycycline 对 HepG2 细胞凋亡的影响　本研究选用 5、20 mg/L 两个药物浓度观察其对 HepG2 细胞凋亡的影响,在 24 h 后各组凋亡率差异无统计学意义（P>0.05） ，而在作用 48、72 h 后各实验组细胞凋亡率较对照组明显增加，P<0.01（表 2，图 2） 2.3　Doxycycline 对 HepG2 细胞 FasL、Fas 及 MMP-2 蛋白表达的影响　本研究选用 20 mg/L Doxycycline 作用 HepG2 细胞观察对 FasL、Fas 及 MMP-2 三种蛋白表达的影响，作用 48 h 后，FasL、Fas 及 MMP-2 三种蛋白表达见表 3其中FasL 蛋白表达积分较对照组明显增加(图 3)，MMP-2 蛋白表达积分较对照组明显降低(图 4)，而 Fas 蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义，P>0.05(图 5)3　讨论Doxycycline 是一种化学修饰的四环素类抗生素，近年来，有关其对肿瘤生长抑制作用的研究报道已被广泛关注Cakir 等［５］发现 5、10 mg/L Doxycycline 对狗骨肉瘤细胞的生长抑制率分别为 50%和 72%，Bettany 等［6］研究发现 Doxycycline 可以诱导兔破骨细胞的凋亡。

本实验结果显示，5~50 mg/L 浓度 Doxycycline 对 HepG2 细胞具有显著的生长抑制作用，并且呈现明显的剂量和时间依赖性Doxycycline 可促进 HepG2 细胞凋亡，随着药物浓度及作用时间的增加，细胞凋亡率亦相应升高，提示 Doxycycline 对人肝细胞肝癌细胞系 HepG2 具有明显的促凋亡作用，进而可抑制肿瘤细胞的生长细胞凋亡是一个比较复杂的过程，可通过多条启动途径实现，其中膜受体途径（Fas/FasL）是最重要的途径之一Liu J 等［7］发现 Doxycycline 可通过Fas/FasL 介导的膜受体途径诱导 T 淋巴细胞凋亡，最近研究报道 Doxycycline能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖，并证实其主要通过 Caspase 依赖的细胞凋亡发挥作用［3］ 有报道表明人肝癌细胞系 HepG2 表面 Fas 有较强的表达［8］ 本研究结果显示 20 mg/LDoxycycline 作用 HepG2 细胞 48 h 后 FasL 蛋白表达明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05） ，而 Fas 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05） 提示 Doxycycline 可能通过上调细胞表面 FasL 的表达而启动 Fas/FasL 介导的信号传导途径诱导细胞凋亡。

有报道 Doxycycline 作为 MMP 抑制剂，具有抑制胶原酶和其他 MMP 的作用［1,5,9］ 体内外实验发现，Doxycycline 对前列腺癌、乳腺癌及骨肉瘤均有明显的抑制作用，并证实它可抑制 MMPs 的表达及活性，从而抑制肿瘤的生长［1-2,9］ MMPs 可通过多种途径调控肿瘤生长，亦可通过降解基底膜及启动血管内4皮细胞生长来促进肿瘤增长及转移［10］ ，还可通过降解 FasL 以减少肿瘤细胞的凋亡［11］ 本研究结果显示，20 mg/L Doxycycline 作用 HepG2 细胞 48 h 后，实验组 MMP-2 表达阳性率与对照组比较明显降低（P<0.05） 推测Doxycycline 抑制体外 HepG2 细胞生长作用可能通过降低 MMP-2 表达，从而减少FasL 的降解,增加其表达，进而启动 Fas/FasL 膜受体途径来促进细胞的凋亡药物对肿瘤的抑制作用机制往。