肠道微生物与果蝇阿尔茨海默病.docx

          肠道微生物与果蝇阿尔茨海默病                    摘要探讨Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc对阿尔茨海默病(AD)转基因果蝇认知功能的影响方法分别建立Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc转基因AD果蝇模型根据实验要求将果蝇分为4组，分别是野生果蝇对照组、Aβ40组、Aβ42组、Aβ42Arc组在整体动物水平上进行果蝇行为学研究，分别检测各组果蝇的嗅觉短期记忆能力、攀爬能力和平均寿命结果在巴甫洛夫嗅觉相关短期记忆测试、攀爬能力试验、平均寿命测试中，与对照组相比，3组转基因果蝇的嗅觉记忆能力、攀爬能力、平均寿命均明显降低结论Aβ的毒性作用会导致AD转基因果蝇认知功能下降关键词：肠道微生物 果蝇 阿尔茨海默病一、研究背景阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆尽管对老年痴呆的研究从未停止过，但是引起的老年痴呆的病因仍不清楚，目前也还没有预防或治疗老年痴呆的有效方法。

β淀粉样蛋白质凝结一直被怀疑是导致老年痴呆症(阿尔茨海默症)的原因之一在大脑中，老年痴呆的病理特点是细胞外的β-淀粉样蛋白聚集形成的老年斑和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结这种蛋白质凝结在老年苍蝇、老鼠和人类的大脑中会越来越多地出现科学家们设想通过细胞水平的清洁过程，即所谓的自体吞噬作用，来溶解和减少这种蛋白质凝结自体吞噬是细胞内形成溶酶体自我消化的过程，是生物体用来回收再利用损坏的细胞器、细胞膜、蛋白和其他细胞部件的机制生物学家已经能够证明内源性物质亚精胺可以引发细胞的自体吞噬作用2009年10月，马德欧教授就曾在《自然·细胞生物学》上发表过相关论文《亚精胺诱导的自体吞噬促进了长寿》而现在，联合研究团队进一步的研究表明，通过给果蝇喂食亚精胺，它们大脑里的蛋白质凝结量明显减少，果蝇的记忆能力因此增加这个结果是通过测量验证的，因为果蝇通过经典的巴甫洛夫条件反射的学习，记住了它们所学到的，并相应地调整其以后的行为我国阿尔茨海默病发病率为10%，在85岁以上的老年人中，发病率高达47%随着社会老龄化的加剧，阿尔茨海默病患病人数逐年增加，极大地影响了患者的生活，同时给家庭、社会带来了精神和经济负担。

第七次全国人口普查主要数据结果显示，我国60周岁及以上老年人口达到2.64亿，占总人口的18.70%，与2010年相比，60周岁及以上人口的比重上升了5.44个百分点，人口老龄化程度进一步加深目前，我国老年人的健康状况不容乐观，超过1.8亿老年人患有慢性病，60岁及以上老年人中阿尔茨海默病患者约有1507万，认知症老年人的照护服务需求呈现快速增长趋势在这种大背景下，中国老龄协会以课题研究为基础，完成了《照护服务报告》，实现了阶段性成果转化《照护服务报告》指出，近年来，虽然我国认知症老年人照护服务工作不断取得新进展，但仍存在专项政策制度不完善、专业照护服务供给不足、社会知晓率偏低、家庭照护经济负担沉重等问题报道指出，2030年我国阿尔茨海默病人数将达到2220万，2050年将达到2898万当老年人口达到峰值时，认知症老年人的照护服务需求也将达到顶峰，需要提前在思想、制度、物质等方面做好全方位的准备二、研究方法1、研究原理果蝇(fruitfly)是双翅目、短角亚目、果蝇科、果蝇属昆虫由于其清晰的遗传背景以及简便的实验操作，使其在遗传学、发育生物学、生物化学以及分子生物学等多个领域都占据了不可替代的位置。

黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)在1830年首次被描述而它第一次被用作试验研究对象则要到1901年，试验者是动物学家和遗传学家威廉·恩斯特·卡斯特他通过对果蝇的种系研究，设法了解多代近亲繁殖的结果和取自其中某一代进行杂交所出现的现象1910年，随着著名的遗传学家汤玛斯·亨特·摩尔根开始在实验室内培育果蝇并对它进行系统的研究，此后很多遗传学家都开始用果蝇作研究并且取得了很多遗传学方面的知识：经典的伴性遗传、连锁以及交换定律，还包括果蝇的性别决定机制以及其基因组测序以及基因在染色体上的分布果蝇作为模式生物，一方面是由于长期积累了很多关于果蝇的知识和信息，制备了大量的突变体，结合其自身携带的便于遗传操作的标记，极大地方便了实验的设计和操作；另一方面，在果蝇遗传研究过程中发展的一些有效的技术，现在还只能应用于果蝇，如定点同源重组以及基因定点敲除技术美国科学家说，他们在果蝇肠道内发现一种干细胞能不断分化成组织细胞，与人类肠道内的干细胞非常相似科学家称，这一发现可能在肠癌等疾病的机理研究中发挥作用2、实验方法建立转基因果蝇AD模型转基因果蝇通过质粒作为外源目的基因载体，用显微注射手段将人源Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc基因转入果蝇染色体上，以杂交方式建立果蝇品系，应用UAS/Gal4激活系统激活在果蝇中枢神经系统中Aβ的表达。

杂交方案:①Aβ42转基因果蝇模型:雌性亲本♀elav/gal4Aβ42(elav-gal4/elav-gal4;UAS-Aβ42/cyo;+/+、红眼直翅)与雄性亲本/野生型2202U♂(+/+;+/+;+/+、白眼直翅)进行杂交子代分配:子代一(elav-gal4/+;cyo/+;+/+、红眼卷翅);子代二(elav-gal4/+;UAS-Aβ42/+;+/+、红眼直翅)目标子代:子代二/红眼直翅为目标子代，雌雄分开后用于试验②正常对照组果蝇:雌性亲本♀elav/gal4/gal4(elav-gal4/elav-gal4;+/+;+/+、红眼直翅);雄性亲本/野生型2202U♂(+/+;+/+;+/+、白眼直翅)子代分配:子代(elav-gal4/+;+/+;+/+、红眼直翅)目标子代:只有一种子代雌雄分开后即可用于试验嗅觉短期记忆缺陷测试在25°C、70%相对湿度T型迷宫装置中进行测试将空气流速为750ml/min的真空管与T-Maze相连，把装有80只成年果蝇的试管快速震荡后倒至电刺激管中，然后将电刺激管与T-Maze相连，用固定器固定T-Maze，然后将含有1．5‰辛醇的气味管相连，通气之后马上打开调频仪及刺激器机箱，使用60V的电压持续刺激1．5s，然后间隔3．5s再给同样振幅和频率的电刺激，电刺激训练1min后停止(即重复刺激12次)。

随后将1．5‰辛醇的气味管与电刺激管分离，通空气45s后，将含有1‰甲基环己醇的气味管与电刺激管相连，通气1min，但不伴有电刺激然后将真空管从T-Maze上拔下，再将含有1‰甲基环己醇的气味管与电刺激分离，快速震动电刺激将其中的果蝇震动到T-Maze圆洞内，迅速推到两个气味管连接处，将1500ml/min的真空管与T-Maze连接，再将两个气味管同时与T-Maze相连，用固定器固定T-Maze，只通气不通电，计时2min最后取下两个气味管震荡，将其中的果蝇分别倒入两个试管中，待冰冻后分别查冻死的果蝇数量根据选择每种气味的果蝇数目计算每次实验的学习记忆指数(performanceindex，PI):PI=(Ncs--Ncs+)/Ncs-+Ncs+)×100%，其中Cs(conditionstimulus)代表条件电击刺激;Ncs-代表往不伴有电击刺激的气味一侧移动的果蝇数目;Ncs+代表往伴有电击刺激的气味一侧移动的果蝇数目;取两种气味PI的平均值作为每组实验数据为了避免气味引起的偏差，两种气味的实验顺序颠倒过来其它3组实验步骤同前果蝇攀爬能力试验将待测每组果蝇分装成每瓶20只，果蝇适应(果蝇置空食瓶内适应5min);轻弹果蝇至平底，果蝇由于习性将向上爬，暗室红灯下测试15s到达瓶顶的果蝇个数A，计算攀附指数(climbingindex，CI)=A/总数。

果蝇的平均寿命测定每组基因的雌果蝇80只，分别装入4个果蝇专用营养管内，做上标签待观察每天更换一次培养基，并记录每次死亡果蝇的数量，直至果蝇全部死亡为止以上实验重复3次计算出半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命3个指标全部果蝇存活天数的均数为平均寿命，最后20只死亡果蝇的生存天数均值为平均最高寿命3、具体内容在巴甫洛夫经典条件作用下，监测对照组、Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc转基因成年果蝇(3天龄)记忆缺陷症状3个实验组分别与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0．01和P＜0．001);Aβ40组与Aβ42相比，差异有统计学意义(P＜0．01);Aβ40组与Aβ42Arc相比，差异有统计学意义(P＜0．01);Aβ42与Aβ42Arc相比，差异无统计学意义(P＞0．05)根据评估结果，4组果蝇的短期嗅觉记忆能力由强到弱依次是:对照组＞Aβ40组＞Aβ42组＞Aβ42Arc组2．2Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc使果蝇攀爬能力下降在第10天时攀爬至顶部的果蝇数:对照组72只、Aβ40组71只、Aβ42组70只和Aβ42Arc组48只第15天时，将果蝇轻弹至瓶底，果蝇沿瓶壁向上爬行的动作非常缓慢而且中间会从瓶壁滑落，攀爬至顶部的果蝇数大幅度减少:对照组68只、Aβ40组52只、Aβ42组32只和Aβ42Arc组20只。

在第30天时，攀爬至顶部的果蝇数:对照组64只、Aβ40组24只、Aβ42组0只和Aβ42Arc组4只4组果蝇的攀爬能力由强到弱依次是:对照组＞Aβ40组＞Aβ42组＞Aβ42Arc组2．3Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc使果蝇寿命缩短测定4组果蝇(每组80只)的平均寿命，结果发现它们在生存时间上存在差异三、数据分析与结论本研究之所以选择转基因果蝇作为实验对象，是因为转基因果蝇模型是研究人类神经系统退行性疾病的理想模型首先，人类和果蝇基因组序列不仅具有很多同源基因，如阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等，而且果蝇的神经退行性疾病模型与人类神经退行性疾病还有许多相似的表型另外，果蝇饲养容易，生长迅速，因此在短时间内就可获得大量子代但也正是因为果蝇生命周期短，不同年龄阶段对其认知功能有一定影响，因此在实验中所用果蝇的年龄需严格控制本研究选择转基因果蝇模型的另一个原因是果蝇嗅觉传导通路中大部分投射神经元既是胆碱能神经元又是胆碱能神经元受体乙酰胆碱是果蝇中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，烟碱性乙酰胆碱介导快速兴奋性神经传导其中，银环蛇毒素敏感的烟碱样胆碱能受体能够介导果蝇浦肯野细胞之间的快速兴奋性突触传递，这些受体可能与嗅觉相关的学习可塑性有关。

果蝇下颚须和触须的嗅觉受体神经元接收的气味信息在嗅神经元内转换成神经电信号，然后沿嗅神经元的轴突传递到触角叶的投射神经元，并在此形成轴－树突触在触角叶进行处理后，嗅觉信息由投射神经元传递果蝇大脑的蘑菇体和前脑区，最终引发为嗅觉记忆反应Aβ如何影响AD认知功能障碍的机制，目前尚不清楚相关研究已经证实AD患者认知功能下降与乙酰胆碱突触传递障碍密切相关本研究中果蝇短期嗅觉记忆实验证实相对于正常对照组而言，Aβ40、Aβ42、Aβ42Arc组的记忆能力明显下降，表明Aβ的过度表达对果蝇的嗅觉记忆能力有明显的损害结合转基因果蝇的行为学研究结果可以推测在转基因模型中Aβ的过度表达对胆碱能突触传递可能有抑制作用，进而导致转基因果蝇的认知功能障碍本研究中嗅觉短期记忆能力、攀爬能力实验及平均寿命分析显示，3组转基因果蝇模型中，Aβ42组和Aβ42Arc组的转基因果蝇嗅觉记忆能力、攀爬能力、平均寿命均出现明显的下降，Aβ42Arc组下降最明显，Aβ40组受损最轻四、参考文献与附录[1]Wu,S.C.,etal.(2017)."Intestinalmicrobialdysbiosisag。