高通量药物筛选与创新药物研究.ppt

高通量药物筛选与创新药物研究内容• 高通量药物筛选：模型建立、化合物制备、自动化、数据处理• 我国高通量药物筛选的现状• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略：组合筛选模型体系、分子家族筛选模型体系、化学生物学方法研究活性化合物作用机制• 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例化合物资源药物发现 DRUG DISCOVERY药物开发 DRUG DEVELOPMENT1. 临床前研究 2. 临床研究药物候选化合物药新1.药物先导化合物的发现 2.药物先导化合物的结构优化新 药 研 究 的 两 个 阶 段分子生物学 细胞生物学 基因组学 蛋白组学生物信息学 结构生物学 计算机辅助药物设计 药物化学高通量筛选 技术天然产物 化学合成 组合化学化合物库筛选模型结构优化先导化合物筛选—药物发现的关键环节—高新技术集中的焦点高通量筛选（HTS）运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选The Evolution of HTS高通量筛选•快速----每天筛选上万药次•微量----筛选样品需要量为微克级•灵敏----准确判断筛选样品的活性和选择性•经济----筛选费用低常规筛选高通量筛选常规筛选和高通量筛选高通量筛选筛选 的四个要素样品制备自动化HTS模型建立数据处理要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。

选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现根据这些结果，我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等Current Drug Targets• Membrane Receptors45% • Enzymes28% • Hormones and Factors11% • Ion Channels5% • DNA2% • Nuclear Receptors2% • Unknown7%N = 483 J. Drews, Science (2000) 287:1962靶点确证• Expression phenotype ? • Mutant ? • Antisense treatment ? • Antibody treatment ? • RNAi ? • Knockout / knockin ? • Inhibitor treatment ?克隆PCR、RT-PCR方 法从cDNA文库、 EST克隆、组织和 细胞的总RNA中 得到关键靶基因亚克隆 大肠杆菌表达系统 酵母表达系统 昆虫表达系统大规模表达、 纯化、复性， 得到纯净重组 蛋白时间光吸收E412nm =13,600 M-1cm-1检测方法的确 定、优化及高 通量筛选模型 的建立分子水平筛选模型建立流程模型设计•体外生化检测–通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等•细胞水平的检测–主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。

体外生化检测显色反应 (Photometry)显色反应方法检测MetAP活性显色反应方法检测MetAP活性荧光强度 (Fluorescence Intensity)7-amino-4-methylcoumarinrhodamine 110resorufinFluorogenic Peptide Substrate荧光偏振 (Fluorescence Polarization)FPTheoretical FP Behavior of a Series of Fluorescent Dyes As a Function of MW尺寸变化IMAPProtein-DNA Binding FP HTSSer/Th Kinase Competitive FP Assay荧光共振能转移(FRET)荧光共振能转移是指供体受激发后不发射出光子而将激发的能量转移到受体的现象这种方法可检测生理状态下相互作用分子间的距离产生FRET需要满足三 个条件：供体和受体间距离接近（10~100埃）；供体的发射光谱与受体的激发光谱必须有重叠；供体和受体之间迁移偶极子的方向必须平行Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)FluorescenceFluorescenceDAEfficient energy transfer: 10–100 ÅAbsorbanceWavelengthAbsorbanceWavelengthDonorAcceptor荧光共振能转移在大多数情况下，供体与受体标记的荧光染料是不同 的，供体的荧光会因为受体的存在而发生淬灭。

一般 荧光素和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）之 间发生50%有效能量转移所需距离为55 埃，EDANS和 DABCYL之间为33埃，EDANS和荧光素之间为46埃 FRET主要用于淬灭分析或与淬灭相关的分析Fluorogenic (Quenched) SubstrateFRETExample of use of FRET in a protease assay Matayoshi et al., Science 247 954 (1990)时间分辨荧光共振能传递 （Time Resolved FRET）LANCE Assay for KinaseLANCE Assay for Transferase and Nuclear receptorLANCE Assay for Protease and HelicaseAlphaScreenAlphaScreen for PIP3AlphaScreen for cAMPBRET闪烁亲近检测法 (Scintillation Proximity Assay, SPA)FlashPlate - SPA without BeadsBind Receptor Or Target to PlateRadiolabeled Tracer and Sample addedOnly bound Tracer is Measured常用的蛋白水解酶检测方法常用的蛋白水解酶检测方法常用的激酶检测方法 常用的磷酸酯酶检测方法以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及 以下几个步骤： – 确定反应条件（如缓冲液、pH、温度） – 天然或合成的底物的确定 – 酶动力学 – 信号窗口的评价 – 对已知抑制剂的反应情况 底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放 射性化学的方法等。

适用的靶点不仅包括蛋白酶、 激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如DNA连接酶和 解旋酶细胞水平检测荧光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反映钙离子的浓度在FLIPR实验中，可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需1秒可进行钙离子内流的动力学检测FLIPR functional screening assayLGTPGDPPLCinositol phosphatesCa2+Fluorescent dye+fluorescent signal报告基因• 报告基因受一个可诱导转录因子的调控，从而响应 受体的活动，并指导报告蛋白的合成 • 对应不同的细胞株，可有多种报告基因和载体可供 选择常用的有萤火虫荧光素酶(luciferase)、分泌 型碱性磷酸酯酶(secreted alakaline phosphatase, SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(chloramiphenicol acetyltransferase, CAT)、-半乳糖苷酶(- galactosidase)、-内酰胺酶和绿色荧光蛋白(GFP) Reporter GeneBait ProteinBinding DomainPrey ProteinActivation Domain• Two hybrid proteins are generated with transcription factor domains • Both fusions are expressed in a yeast cell that carries a reporter gene whose expression is under the control of binding sites for the DNA-binding domainThe Two-Hybrid SystemReporter GeneBait ProteinBinding DomainPrey ProteinActivation DomainThe Two-Hybrid System• Interaction of bait and prey proteins localizes the activation domain to the reporter gene, thus activating transcription. • Since the reporter gene typically codes for a survival factor, yeast colonies will grow only when an interaction occurs. Quantum dots • Invitrogen 公司的Qdot技术–Quantum dots 是一种与蛋白质尺寸相当的半导体材料，具有独特的荧光特性。

已成为筛选药物的有利工具•荧光持续时间时间长，适合时间分辨检测•颜色多样，在同一激发波下，不同尺寸的微利可发出多种激发光，加上其表面可以耦联多种生物分子，可同时标记多个靶点•安全：细胞毒性低，可用于活细胞或者体内研究Qdot的结构High Content ScreeningHigh Content Screening•Cellomics –ArrayScan –KineticScan •Molecular Devices –Discovery-1Visualize and analyze cell populationsIdentify sub-cellular protein localizationPerform multi-parameter analysis• Live cell assays to detect translocation of signaling proteins:– primary screening– lead profiling• Pathway screening for functional effect, rather than specific mode of action (e.g.: in vitro binding, catalytic activity).• Modulation of protein translocation is an alternative to inhibition of catalytic activity: protein translocation modulators.Translocation Assay Protein Translocation is Essential for Intracellular SignalingThe PKB/Akt PathwayGreater Selectivity with Translocation Modulators‘Active Site’ inhibitors often lack specificity and selectivity  。