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酶的分离与纯化.ppt

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    • 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化n教学目标:教学目标:Ø了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略Ø理解酶分离纯化的一般原则理解酶分离纯化的一般原则、、酶分离和纯化方法酶分离和纯化方法Ø掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理n教学重点:教学重点: 细胞破碎的方法与特点、细胞破碎的方法与特点、酶酶分离方法分离方法n教学难点:教学难点: 酶酶分离方法特点分离方法特点 第四讲第四讲 酶的分离与纯化酶的分离与纯化4.14.1、酶的提取和分离纯化、酶的提取和分离纯化4.24.2、酶的分离纯化策略、酶的分离纯化策略4.34.3、酶的分离纯化与制备过程、酶的分离纯化与制备过程GoGoGoGoGoGo 4.14.1、酶的提取和分离纯化、酶的提取和分离纯化细胞破碎细胞破碎提取酶提取酶酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离、过滤分离、沉淀分离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶分离等取分离、结晶分离等指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。

      指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度已知绝大多数酶是蛋白质,因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化已知绝大多数酶是蛋白质,因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化 Ø酶的分离纯化一般程序:酶的分离纯化一般程序:l①①预处理:预处理:材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎l②②粗分级分离:粗分级分离:又称初步纯化或提取,采用适当的又称初步纯化或提取,采用适当的 方法将目的酶与其他杂蛋白分离开方法将目的酶与其他杂蛋白分离开l③③细分级分离:细分级分离:又称高度纯化,即酶的精制又称高度纯化,即酶的精制l④④成品制作:成品制作:使酶与溶剂分离使酶与溶剂分离 4.24.2、酶的分离纯化策略、酶的分离纯化策略l①①防止酶的变性失活防止酶的变性失活l②②储存及所有操作一般在低温下(储存及所有操作一般在低温下(0~~4℃)进行)进行l③③整个过程中反应系统整个过程中反应系统pH要适中(要适中(pH4~~6))l④④操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成1 1、、基本原则基本原则 2 2、分离纯化策略、分离纯化策略Ø1 1)目的明确)目的明确Ø2 2)建立一个可靠、快速的分析方法)建立一个可靠、快速的分析方法Ø3 3)纯化方法的选择)纯化方法的选择 1)目的明确u酶分离纯化的最终目的就是要获得高纯度的酶,使使用的目用的目的不同,对酶的纯度要求也不同。

      u纯度的要求必须考虑到原料的性质、终产物的预期用途和特殊的安全性问题u所有关于目标酶蛋白目标酶蛋白及关键杂质关键杂质的性质的信息都有助于指导人们在纯化过程中选择分离技术和操作条件u虽然纯化的步骤越少越好纯化的步骤越少越好,但必须保证终产物的质必须保证终产物的质量量应尽早除去可引起目标蛋白降解、失活或干扰分析的杂质在每个纯化步骤中都应考虑维持酶蛋白的生物活性 2 2)建立一个可靠、快速的分析方法)建立一个可靠、快速的分析方法l①①快速、可靠的快速、可靠的分析目标酶蛋白分析目标酶蛋白的方法的方法l②②蛋白质纯度检测蛋白质纯度检测方法方法l③③总蛋白量检测总蛋白量检测方法方法l④④对必须清除的对必须清除的杂质杂质的分析方法的分析方法 3 3)纯化方法的选择)纯化方法的选择l纯化过程纯化过程不宜重复相同的步骤和条件不宜重复相同的步骤和条件l减少减少添加剂添加剂的使用的使用l尽早去除有破坏性的尽早去除有破坏性的杂质杂质l尽早采用尽早采用高效分离方法高效分离方法,将,将最昂贵最费时最昂贵最费时的分离方的分离方法放在最后阶段法放在最后阶段评价纯化方法好坏标准评价纯化方法好坏标准:比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性:比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性 酶纯度检验酶纯度检验::电泳法、高效液相色谱法电泳法、高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)、化学结构分析法、、化学结构分析法、 超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法 4.34.3、酶的分离纯化与制备过程、酶的分离纯化与制备过程Ø1 1、材料的预处理、材料的预处理Ø2 2、细胞破碎(胞内酶)、细胞破碎(胞内酶)Ø3 3、酶的提取、酶的提取Ø4 4、酶的分离纯化方法及选择、酶的分离纯化方法及选择Ø5 5、酶的精制及方法、酶的精制及方法Ø6 6、酶制剂的类型、酶制剂的类型 1 1、材料的预处理、材料的预处理u酶的来源于酶的来源于动物、植物的器官组织、微生物细胞动物、植物的器官组织、微生物细胞发酵发酵。

      u微生物细胞产酶包括微生物细胞产酶包括胞内酶胞内酶与与胞外酶胞外酶,两种情况,两种情况都涉及将微生物细胞与发酵液进行都涉及将微生物细胞与发酵液进行分离分离u常用的分离方法主要是常用的分离方法主要是离心离心和和过滤过滤两种 2、细胞破碎(胞内酶)l指采用物理、化学或生物的方法使指采用物理、化学或生物的方法使细胞壁或细胞膜破细胞壁或细胞膜破碎碎,从而使得细胞内的酶得到释放从而使得细胞内的酶得到释放l细胞破碎的方法可分为细胞破碎的方法可分为机械法机械法和和非机械法非机械法两类目前两类目前工业上最常用的是工业上最常用的是机械法机械法 JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机胞粉碎机高高压细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀玻璃匀浆机机细胞胞破破碎碎珠珠 机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎★★有机溶剂:有机溶剂:甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿★★表面活性剂:表面活性剂:Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力,使组织、细胞破碎力,使组织、细胞破碎通过各种物理因素的作用,通过各种物理因素的作用,使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏,而使细胞破碎。

      坏,而使细胞破碎通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用,而使细胞破碎膜的作用,而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用,使加酶制剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏,细胞外层结构受到破坏,而达到细胞破碎而达到细胞破碎★★细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理 3 3、酶的提取、酶的提取l指在一定条件下,用适当的指在一定条件下,用适当的溶剂或溶液处理溶剂或溶液处理含酶原料,含酶原料,使酶使酶充分溶解充分溶解到溶剂或溶液中的过程到溶剂或溶液中的过程, ,也称为也称为酶的抽提酶的抽提l首先应根据首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂一般说来,般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中;酸性物质易溶于碱性溶剂中,于非极性的有机溶剂中;酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中碱性物质易溶于酸性溶剂中l一般酶都能溶解于水,通常可用一般酶都能溶解于水,通常可用水水或或稀酸、稀碱、稀盐稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取溶液等进行提取,有些酶与,有些酶与脂质脂质结合或含有较多的结合或含有较多的非极非极性基团性基团,则可用,则可用有机溶剂有机溶剂提取。

      提取l为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中还要注意控制好中还要注意控制好温度、温度、pHpH值值等提取条件等提取条件 ★★酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶剂或溶液使用的溶剂或溶液提取对象提取对象盐溶液提取盐溶液提取0.02~~0.5mol/L的盐溶液的盐溶液用于提取在用于提取在低浓度低浓度盐溶液中溶解盐溶液中溶解度较大的酶度较大的酶酸溶液提取酸溶液提取pH2~~6的水溶液的水溶液用于提取在用于提取在稀酸溶液稀酸溶液中溶解度大,中溶解度大,且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶碱溶液提取碱溶液提取pH8~~12的水溶液的水溶液用于提取在用于提取在稀碱溶液稀碱溶液中溶解度大中溶解度大且稳定性较好的酶且稳定性较好的酶有机溶剂提取有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多含有较多非极性基团非极性基团的酶的酶 讨论:讨论:提高酶分子扩散速度手段提高酶分子扩散速度手段u提高温度提高温度u降低溶液粘度降低溶液粘度u增加扩散面积增加扩散面积u缩短扩散距离缩短扩散距离u增大浓度差增大浓度差 4 4、酶的分离纯化方法、酶的分离纯化方法l一、根据一、根据溶解度溶解度不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法l二、按照二、按照分子大小分子大小不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法l三、依据三、依据电学解离性质电学解离性质不同建立的纯化方法不同建立的纯化方法l四、利用四、利用亲和作用特性亲和作用特性建立的纯化方法建立的纯化方法l五、利用五、利用稳定性差异稳定性差异建立的纯化方法建立的纯化方法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等点沉淀法等点沉淀法有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 萃取分离萃取分离凝胶过滤凝胶过滤膜分离膜分离离子交换色谱离子交换色谱电泳电泳聚焦色谱聚焦色谱亲和色谱亲和色谱亲和膜亲和膜热变性法热变性法酸碱变性法酸碱变性法表面变性法表面变性法 ★★盐析法盐析法l大多数蛋白类酶都溶于水,而且在大多数蛋白类酶都溶于水,而且在低浓度的盐低浓度的盐存在存在的条件下,酶的溶解度随盐浓度的升高而增加,这的条件下,酶的溶解度随盐浓度的升高而增加,这称为称为盐溶现象盐溶现象。

      l在高浓度盐溶液中,蛋白质的溶解度随盐浓度增加而减少而沉淀而析出,这种现象称为盐析盐析 ★★盐析方法:盐析方法:lKs分段盐析:Ø 在一定的温度和pH值条件下(β为常数),通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法lβ分段盐析:Ø 在一定的盐和离子强度的条件下(Ks为常数),通过改变温度和pH值,使不同酶或蛋白质分离的方法 在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等,其硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等,其中以中以硫酸铵硫酸铵最为常用最为常用u溶解度大溶解度大(25℃时达达4.1mol//L)u溶解温度系数小溶解温度系数小(0℃为706g//L,,25℃为767g//L),即使是在低温的溶解度范,即使是在低温的溶解度范围内,几乎所有的蛋白内,几乎所有的蛋白质都能都能盐析出来析出来u价格便宜价格便宜u浓度高度高时不易引起蛋白不易引起蛋白质生物活性的生物活性的丧失失 u在盐析时,溶液中硫酸铵的浓度通常以在盐析时,溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度饱和度表示饱和度指溶液中饱和硫酸铵体积与溶液总体积之比饱和度指溶液中饱和硫酸铵体积与溶液总体积之比u添加方法:添加方法:Ø1 1)添加饱和硫酸铵溶液)添加饱和硫酸铵溶液Ø2 2)加固体硫酸铵,固体硫酸铵的加入量可以查表)加固体硫酸铵,固体硫酸铵的加入量可以查表 分析盐析的特点及影响因素分析盐析的特点及影响因素l优点:优点: 操作简便、安全、重现性好,适用范围广泛,同操作简便、安全、重现性好,适用范围广泛,同时能够达到浓缩蛋白质的目的。

      时能够达到浓缩蛋白质的目的l缺点:缺点: 分辨率差、纯度倍数低、沉淀含有大量的盐分分辨率差、纯度倍数低、沉淀含有大量的盐分l影响因素:影响因素: pHpH值、温度、蛋白质浓度等值、温度、蛋白质浓度等 ★★有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法l原理:原理: 利用酶在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法利用酶在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法l常用的有机溶剂:乙醇、常用的有机溶剂:乙醇、丙酮丙酮、异丙醇、甲醇等、异丙醇、甲醇等 ★★有机溶剂沉淀法要求:有机溶剂沉淀法要求:u溶剂必须能与水完全混合,不与蛋白质发生反应;溶剂必须能与水完全混合,不与蛋白质发生反应;u溶剂蒸气无毒且不易燃烧;溶剂蒸气无毒且不易燃烧;u溶剂用量一般为酶液体积的溶剂用量一般为酶液体积的2 2倍左右,必须预先冷却倍左右,必须预先冷却到到-20℃-20℃左右在搅拌下缓慢加入;左右在搅拌下缓慢加入;u沉淀析出后尽快在低温下(沉淀析出后尽快在低温下(0℃0℃以下)离心分离,用以下)离心分离,用冷缓冲液溶解以降低有机溶剂的浓度;冷缓冲液溶解以降低有机溶剂的浓度;upHpH尽可能在靠近目标酶的等电点尽可能在靠近目标酶的等电点。

      ★★有机溶剂沉淀法的特点:有机溶剂沉淀法的特点:l优点:优点: 分辨率高,溶剂容易除去分辨率高,溶剂容易除去l缺点:缺点: 蛋白质在有机溶剂中易变性蛋白质在有机溶剂中易变性 ★★等电点沉淀法等电点沉淀法 l原理:原理:Ø 利用两性电解质在利用两性电解质在等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低,以及不,以及不同的两性电解质具有不同的等电点,通过同的两性电解质具有不同的等电点,通过调节溶液调节溶液的的pHpH值值,使酶或杂质沉淀析出使酶或杂质沉淀析出l在加酸或加碱调节在加酸或加碱调节pHpH值过程中,值过程中,边加边搅拌并缓慢边加边搅拌并缓慢进行进行,以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活l由于在等电点时酶蛋白分子表面的由于在等电点时酶蛋白分子表面的水化膜水化膜仍然存在,仍然存在,使酶仍有一定的溶解度,沉淀往往不完全,一般很使酶仍有一定的溶解度,沉淀往往不完全,一般很少单独使用少单独使用 ★★有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法l原理:原理: 在酶液中加入某些在酶液中加入某些高分子物质高分子物质,使其与酶,使其与酶形成聚合形成聚合物物而沉淀下来。

      而沉淀下来l离子型表面活性剂:十二烷基磺酸钠离子型表面活性剂:十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS);;l非离子型聚合物:聚乙二醇非离子型聚合物:聚乙二醇(PEG) (PEG) l聚丙烯酸聚丙烯酸:因为聚丙烯酸上带有大量的羧基,沉淀:因为聚丙烯酸上带有大量的羧基,沉淀带正电的蛋白质,两者结合形成很大的颗粒而沉淀带正电的蛋白质,两者结合形成很大的颗粒而沉淀下来,加入钙离子后,聚丙烯酸形成钙盐,使蛋白下来,加入钙离子后,聚丙烯酸形成钙盐,使蛋白质游离出来,从而使蛋白质纯化质游离出来,从而使蛋白质纯化 ★★萃取分离萃取分离l原理:原理:Ø利用溶质在互不相溶的两相之间利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同分配系数的不同而而分离u①①双水相萃取双水相萃取 u②②超临界流体萃取超临界流体萃取 u③③反胶团萃取反胶团萃取 ①①双水相萃取双水相萃取l原理:原理:Ø 利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相系统中分配系数的不同而达到分离目系统中分配系数的不同而达到分离目 l优点:优点:①①萃取过程条件温和(两相中含有萃取过程条件温和(两相中含有70%以上的水),酶活%以上的水),酶活力损失较少,处理量可大可小;力损失较少,处理量可大可小;②②设备简单,仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心设备简单,仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心机;机;③③操作方便、快捷,回收率一般可达操作方便、快捷,回收率一般可达80%~%~90%。

      % ★★各种双水相系统各种双水相系统聚合物聚合物P聚合物聚合物Q或或盐聚丙二醇聚丙二醇甲基聚丙二醇,聚乙二醇,聚乙甲基聚丙二醇,聚乙二醇,聚乙烯醇,聚乙醇,聚乙烯吡吡咯咯烷酮,,羟丙基葡聚糖,葡聚糖丙基葡聚糖,葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇聚乙聚乙烯醇,葡聚糖,聚蔗糖醇,葡聚糖,聚蔗糖甲基甲基纤维素素羟甲基葡聚糖,葡聚糖甲基葡聚糖,葡聚糖乙基乙基羟乙基乙基纤维素素葡聚糖葡聚糖羟丙基葡聚糖丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖聚乙二醇聚乙二醇硫酸硫酸镁,硫酸,硫酸铵,硫酸,硫酸钠,甲酸,甲酸钠,酒石酸,酒石酸钾钠 Ø利用利用PEGl500//NaH2PO4体系三步双水相萃取法体系三步双水相萃取法l回收率达回收率达96.396.3%,纯化倍数为%,纯化倍数为3333 ②②超临界流体萃取超临界流体萃取l原理:原理:Ø将超临界流体作为萃取溶剂,利用分离物质与杂质将超临界流体作为萃取溶剂,利用分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同分离在超临界流体中的溶解度不同分离l超临界流体:超临界流体:指物质状态超过临界点后的流体指物质状态超过临界点后的流体Ø物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间,黏度大物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间,黏度大大低于液体的黏度,接近气体的黏度,有利于物质扩散;大低于液体的黏度,接近气体的黏度,有利于物质扩散;Ø扩散系数接近于气体,是通常液体的近百倍,可迅速渗扩散系数接近于气体,是通常液体的近百倍,可迅速渗透到物体的内部而溶解目标物质,快速达到萃取平衡。

      透到物体的内部而溶解目标物质,快速达到萃取平衡 常见超临界流体的超临界点和超临界密度常见超临界流体的超临界点和超临界密度流体名称流体名称临界温度临界温度(℃)临界压力临界压力(Mpa)临界密度临界密度((g/ml))乙烷乙烷C2H632.34.880.203丙烷丙烷C3H896.94.260.220丁烷丁烷C4H10152.03.800.228戊烷戊烷C5H12296.73.280.232乙烯乙烯C2H49.95.120.227氨氨NH3132.411.280.236二氧化碳二氧化碳 CO231.17.380.46二氧化硫二氧化硫 SO2157.67.880.525水水H2O374.322.110.326笑气笑气N2O36.57.170.451氟里昂氟里昂C28.83.900.578 ★★最常用超最常用超临界流体界流体为CO2l临界点的温度为临界点的温度为31.1℃,接近常温,接近常温l临界压力较低,为临界压力较低,为7.38MPal无毒、操作较安全,且液体二氧化碳的扩散系数大,无毒、操作较安全,且液体二氧化碳的扩散系数大,可获得高的传递速率可获得高的传递速率l溶剂容易从产品中分离出来溶剂容易从产品中分离出来 ③③反胶团萃取反胶团萃取 l反胶团反胶团是是两性表面活性剂两性表面活性剂在在非极性有机溶剂非极性有机溶剂中中亲水基团亲水基团自发自发地向内聚集而成的微小胶团,反胶团的形成使地向内聚集而成的微小胶团,反胶团的形成使有机相内形成有机相内形成了分散的亲水微环境了分散的亲水微环境,使生物分子在有机相,使生物分子在有机相( (萃取相萃取相) )内存在内存在于反胶团的亲水微环境中,消除了蛋白质难溶于有机相中或于反胶团的亲水微环境中,消除了蛋白质难溶于有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象。

      在有机相中发生不可逆变性的现象l表面活性剂类型:阴离子型、阳离子型、非离子型表面活性剂类型:阴离子型、阳离子型、非离子型l非极性有机溶剂:环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷非极性有机溶剂:环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷l通过控制通过控制pHpH值、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂值、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂的种类和浓度等条件,可以改变蛋白质在两相中的分配系数,的种类和浓度等条件,可以改变蛋白质在两相中的分配系数,不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它在两相中的分不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它在两相中的分配系数不同,从而达到分离的目的配系数不同,从而达到分离的目的l特点:特点: 成本低、溶剂反复使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活成本低、溶剂反复使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活 ★★凝胶过滤(也称凝胶色谱)凝胶过滤(也称凝胶色谱)l原理:原理: 利用凝胶的网状结构利用凝胶的网状结构根据分子大小根据分子大小进行分离,通常进行分离,通常以柱色谱的方式进行,柱中填充的介质是具有一定以柱色谱的方式进行,柱中填充的介质是具有一定孔径的球状凝胶物质,常用于生物大分子的分离。

      孔径的球状凝胶物质,常用于生物大分子的分离l特点:特点: 快速、简便、不需要再生处理即可反复使用快速、简便、不需要再生处理即可反复使用 ★★凝胶过滤介质品种:凝胶过滤介质品种:l葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系列、列、Sephacryl系列、系列、Sephadex系列、聚乙系列、聚乙烯醇系列、烯醇系列、Bio-Beads S~~X系列等l最常用的凝胶有最常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶凝胶、琼脂糖凝胶排列组成的链状多糖等排列组成的链状多糖等 u柱色谱操作:柱色谱操作:色谱介质的平衡、装柱、加样、扩展色谱介质的平衡、装柱、加样、扩展(包括洗涤和洗脱包括洗涤和洗脱)以及与此同时进行的流出液成分以及与此同时进行的流出液成分(蛋白蛋白质或酶活性质或酶活性)的检测和收集的检测和收集 ★★膜分离膜分离 l原理:原理: 利用微孔超滤膜选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的利用微孔超滤膜选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的l分类:分类:②②根据膜分离过程推动力本质分类:根据膜分离过程推动力本质分类:③③按材料分:天然高分子材料膜、有机按材料分:天然高分子材料膜、有机( (合成合成) )高分子聚合物膜、高分子聚合物膜、无机多孔材料膜无机多孔材料膜④④按膜结构:对称性膜、不对称膜、复合膜按膜结构:对称性膜、不对称膜、复合膜①①按膜孔径大小进行分类:按膜孔径大小进行分类: ★★超滤技术超滤技术l超滤技术是近年来依托于材料科学发展起来的先进超滤技术是近年来依托于材料科学发展起来的先进的膜分离技术,超滤分离精度介于纳滤与微滤之间。

      的膜分离技术,超滤分离精度介于纳滤与微滤之间l超滤膜通常使用的材料都是高分子聚合物,如聚砜超滤膜通常使用的材料都是高分子聚合物,如聚砜类、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等类、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等l通常超滤膜所标称的截留分子质量,对具有相同分通常超滤膜所标称的截留分子质量,对具有相同分子质量的线形分子和球形蛋白质类分子,物质的截子质量的线形分子和球形蛋白质类分子,物质的截留率分别应留率分别应≥90%和%和≥95%l目前常用超滤膜的截留分子质量范围在目前常用超滤膜的截留分子质量范围在1~~1000kDa之间 工业上常用超滤膜器件工业上常用超滤膜器件 膜组件膜组件比表面积比表面积((m2/m3))设备设备费用费用操作费操作费膜面吸附层膜面吸附层的控制的控制应用应用管式管式20~~30极高极高高高很容易很容易UF、、MF平板式平板式400~~600高高低低容易容易UF、、MF螺旋卷式螺旋卷式800~~1000低低低低难难UF、、MF、、RO毛细管式毛细管式600~~1200低低低低容易容易UF、、MF、、中空纤维式中空纤维式10000很低很低低低很难很难UF、、RO ★★离子交换色谱离子交换色谱 l原理:利用离子交换剂上的可解离基团对各种原理:利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子离子的作用力的作用力不同而达到分离目的。

      通常是在固定相和流动相之间发生的不同而达到分离目的通常是在固定相和流动相之间发生的可逆的离子交换反应可逆的离子交换反应l离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质,通过离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质,通过在不溶性高分子物质在不溶性高分子物质(母体母体) 引入可解离的基团(活性基团)引入可解离的基团(活性基团)而制成的,这些基团在水溶液中可与其它阳离子或阴离子起而制成的,这些基团在水溶液中可与其它阳离子或阴离子起交换作用交换作用l按照离子交换剂的不同又可分为按照离子交换剂的不同又可分为阳离子交换剂阳离子交换剂(cation exchanger)和和阴离子交换剂阴离子交换剂(anion exchangerl解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂,碘酸基是强阳解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂,碘酸基是强阳离子交换剂而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂,如羧离子交换剂而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂,如羧甲基是弱酸性阳离子交换剂甲基是弱酸性阳离子交换剂 离子交换色谱操作过程:离子交换色谱操作过程:Ø预处理预处理Ø加样吸附加样吸附Ø洗涤洗涤Ø洗脱洗脱 ★★电电 泳泳 l原理:原理: 利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化。

      利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化分类:分类: Ø(1)(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 Ø(2)(2)等电聚焦电泳等电聚焦电泳Ø(3)(3)连续凝胶电泳连续凝胶电泳 Ø(4)(4)连续流动电泳连续流动电泳 Ø(5)(5)无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳 (1)聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶电泳: (polyacrylamide gel electrophoresis,,PAGE)l以聚丙以聚丙烯酰胺凝胶作胺凝胶作为支持介支持介质,由,由单体丙体丙烯酰胺胺(acrylamide)和和亚甲基双丙甲基双丙烯酰胺胺(N,,N’-methylene bisacryl amide)聚合而成的聚合而成的lPAGE是蛋白是蛋白质研究中最常用的研究中最常用的电泳方法,常用的聚丙泳方法,常用的聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳是泳是垂直平板垂直平板电泳泳,以不,以不连续方式方式进行,行,即即电泳的胶与泳的胶与缓冲体系都具有不冲体系都具有不连续性l特点:特点: 浓缩效效应、、电荷效荷效应、分子、分子筛效效应、高分辨率、高分辨率ØSDS-PAGE主要用于蛋白主要用于蛋白质的的纯度分析和分子量度分析和分子量测定。

      定 (2)等电聚焦电泳:等电聚焦电泳:l利用蛋白利用蛋白质等两性等两性电解解质具有等具有等电点,在点,在等等电点点pH值下呈下呈电中性中性,从而不,从而不发生泳生泳动特点而特点而进行的行的电泳分离l在在电泳泳设备中首先需中首先需调配配连续的的pH梯度梯度,然后使蛋白,然后使蛋白质在在电场作用下泳作用下泳动到与各自等到与各自等电点相等的点相等的pH值区域区域而不再而不再继续泳泳动,形成具有不同等,形成具有不同等电点的蛋白点的蛋白质区区带l调配配稳定的定的连续pH梯度一般采用梯度一般采用氨基酸混合物或氨基氨基酸混合物或氨基酸聚合酸聚合羧酸的酸的缓冲液冲液如已经商商业化化载体体Ampholine为数百种数百种组分的混合物,各分的混合物,各组分具有不同等分具有不同等电点,一般有点,一般有pH4~~6、、pH8~~10、、pH9~~11 3种种pH梯度范梯度范围供供选择 (3)连续凝胶电泳:连续凝胶电泳:Ø连续凝胶电泳实质上是聚丙烯酰胺凝胶垂直平连续凝胶电泳实质上是聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳的发展,实现了在批次内连续将各个电板电泳的发展,实现了在批次内连续将各个电泳区带分离回收,并可进行多批次分离操作。

      泳区带分离回收,并可进行多批次分离操作在电场作用下,电泳形成的区带依次连续走出在电场作用下,电泳形成的区带依次连续走出凝胶并进行洗脱、收集,达到将各组分分离回凝胶并进行洗脱、收集,达到将各组分分离回收的目的;收的目的; (4)连续流动电泳:连续流动电泳:l最早使用的连续流动电泳是在最早使用的连续流动电泳是在纸电泳纸电泳的基础上发展的基础上发展起来的以滤纸为载体,可以减少分离组分在流动起来的以滤纸为载体,可以减少分离组分在流动的缓冲液中的自由扩散将滤纸的上端插入电泳液的缓冲液中的自由扩散将滤纸的上端插入电泳液槽中,槽中,依靠毛细管虹吸作用和重力作用依靠毛细管虹吸作用和重力作用,电泳液沿,电泳液沿着纸面向下均匀流动,在垂直于电泳缓冲液流动方着纸面向下均匀流动,在垂直于电泳缓冲液流动方向施加电场,即在滤纸的两个侧边上与电极接触,向施加电场,即在滤纸的两个侧边上与电极接触,将欲分离的样品以定点方式流加在滤纸上,加样点将欲分离的样品以定点方式流加在滤纸上,加样点的位置需根据各组分的电泳行为确定在电场作用的位置需根据各组分的电泳行为确定在电场作用下带有不同电荷的组分随着电泳缓冲液向前流动的下带有不同电荷的组分随着电泳缓冲液向前流动的同时而向不同的电极方向迁移同时而向不同的电极方向迁移。

      (5)无载体连续流动电泳:无载体连续流动电泳:Ø又称又称为连续自由流自由流动电泳,泳,实质上与上与连续流流动载体体电泳泳类似,只是不使用似,只是不使用载体,而使用两体,而使用两张塑料板,在它塑料板,在它们之之间形成形成0.5~~0.8mm的的间隙作隙作为电泳槽,使泳槽,使电泳泳缓冲液从冲液从下到上平行流下到上平行流过电泳槽,依靠表面泳槽,依靠表面张力减少液体内部的力减少液体内部的流流动性,待分离性,待分离样品从下端某一点品从下端某一点连续加入,在垂直于加入,在垂直于电泳泳缓冲液流冲液流动方向上的方向上的电场作用下,作用下,带有不同有不同电荷的荷的各个各个组分分分分别向不同的向不同的电极方向迁移,在极方向迁移,在电泳槽的末端,泳槽的末端,将流出的将流出的电泳泳缓冲液分割,再分冲液分割,再分别检测、收集,即可、收集,即可获得分离的各个得分离的各个组分 u多孔膜自由流动电泳示意图多孔膜自由流动电泳示意图Ø利用利用多孔膜多孔膜将将电泳槽分离成多个小池,在泳槽分离成多个小池,在电场作用下,作用下,电泳分离的物泳分离的物质可透可透过膜在小池之膜在小池之间迁移,在各小池迁移,在各小池流流动的的电泳泳缓冲液不冲液不仅可起到可起到带走走电泳泳产生的生的热量的量的作用,同作用,同时也可收集也可收集电泳泳产生的不同区生的不同区带,从而达到,从而达到分离的目的。

      分离的目的 u聚焦色谱聚焦色谱l原理:原理: 当用特种的当用特种的缓冲液滴定和淋洗填装在色冲液滴定和淋洗填装在色谱柱中的特柱中的特种多种多缓冲交冲交换剂时,随着,随着这种种缓冲液的冲液的扩展,会在色展,会在色谱柱中自上而下地建立起柱中自上而下地建立起连续的的pH梯度梯度,将待,将待纯化化样品品加入加入该色色谱柱,其中的蛋白柱,其中的蛋白质组分就将随着多分就将随着多缓冲液的冲液的扩展按各自的等展按各自的等电点聚焦于相点聚焦于相应的的pH值区段并随区段并随扩展展过程中程中pH梯度的逐梯度的逐渐下降,最后分下降,最后分别从色从色谱柱先后流柱先后流出,从而达到分离出,从而达到分离纯化的目的化的目的Ø兼有等兼有等电聚焦聚焦电泳的高分辨率和柱色泳的高分辨率和柱色谱简便的便的优点点 ★★亲和色谱亲和色谱l原理:原理: 与酶发生结合的配基通过与酶发生结合的配基通过偶联反应偶联反应固定于色谱柱料载体上,固定于色谱柱料载体上,当样品流过色谱柱时,目标酶即迅速当样品流过色谱柱时,目标酶即迅速吸附吸附于其上,而杂蛋白于其上,而杂蛋白则在此过程中随缓冲液流出,而后可以通过在则在此过程中随缓冲液流出,而后可以通过在洗脱液洗脱液中加入中加入亲和力更强的配基,通过竞争作用使酶与配基解离,也可通亲和力更强的配基,通过竞争作用使酶与配基解离,也可通过改变条件促进色谱系统的解吸,选择性地将酶从亲和吸附过改变条件促进色谱系统的解吸,选择性地将酶从亲和吸附柱上分离下来。

      柱上分离下来l酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅助因子、抗原与抗体、酶酶RNARNA与互补的与互补的RNARNA分子或片段、分子或片段、RNARNA与互补的与互补的DNADNA分子或片段分子或片段等之间,都是具专一而又可逆亲和力的生物分子对等之间,都是具专一而又可逆亲和力的生物分子对 u亲和色谱原理及过程亲和色谱原理及过程 ★★选择性热变性法选择性热变性法Ø即在即在严格控制的条件下,将格控制的条件下,将酶酶溶液迅速升温到某一温度溶液迅速升温到某一温度并保温一定并保温一定时间(通通过试验确定确定),而后迅速冷却,而后迅速冷却,,这样大量不耐大量不耐热的的杂蛋白就将蛋白就将变性析出,通性析出,通过离心可除去,离心可除去,而而酶酶的的总活力活力损失很少,同失很少,同时比活力大大上升比活力大大上升u在在酶酶溶液溶液进行行热处理前加入理前加入该酶酶的底物、的底物、辅酶酶、、竞争性抑制争性抑制剂、、保保护巯基的基的还原原剂等,以增大等,以增大酶酶和和杂蛋白蛋白问的耐的耐热性差性差别u严格控制溶液的格控制溶液的pH值,因,因为不同不同pH值条件下条件下酶酶的的热稳定性是有定性是有差差别的,只有在一定的的,只有在一定的pH值条件下,才可能使操作具有条件下,才可能使操作具有较好的好的重重现性,尤其是在性,尤其是在样品溶液有蛋白品溶液有蛋白酶酶污染的情况下,染的情况下,应用此法用此法时应特特别谨慎。

      慎u胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶 ★★选择性酸碱变性法选择性酸碱变性法u如果在一定温度下,目如果在一定温度下,目标酶酶表表现出出较强强的耐酸性的耐酸性或耐碱性,而或耐碱性,而这一条件一条件对大多数蛋白大多数蛋白质是不是不稳定定的,那么可以将溶液的的,那么可以将溶液的pH值严格控制在一定范格控制在一定范围内并内并处理一定理一定时间,同,同样可达到一定的可达到一定的纯化效化效果u与与选择性性热变性相比,酸碱性相比,酸碱变性性应用得不多,主用得不多,主要原因可能在于操作要原因可能在于操作较为复复杂,条件不易控制,,条件不易控制,而且而且纯化效果化效果较差 ★★表面变性法表面变性法l利用利用酶酶溶液和惰性液体溶液和惰性液体(三三氯甲甲烷)混合振混合振荡,造成,造成选择性表面性表面变性性,振,振荡处理后混合液通常分理后混合液通常分为三三层:上:上层为未未变性蛋白性蛋白质,中,中间层为乳乳浊状状变性蛋白性蛋白质.下.下层为三三氯甲甲烷l利用泡沫形成也可达到利用泡沫形成也可达到选择性表面性表面变性的目的性的目的u应用表面用表面变性法性法时需控制的因素很多,除了泡沫大小以及泡沫形需控制的因素很多,除了泡沫大小以及泡沫形成的速度外,成的速度外,pH值和温度也十分重要。

      和温度也十分重要u和酸碱和酸碱变性一性一样,它的,它的应用面用面远不如不如选择性性热变性Ø过氧化氧化氢酶酶、醇脱、醇脱氢酶酶和和α-淀粉淀粉酶酶Ø通通氯气气到到磷酸核糖磷酸核糖变位位酶酶和和核苷磷酸化核苷磷酸化酶酶的溶液中,的溶液中,可使磷酸核糖可使磷酸核糖变位位酶酶表面表面变性而性而纯化核苷磷酸化化核苷磷酸化酶酶 5 5、酶的精制、酶的精制l一、酶的浓缩一、酶的浓缩l二、酶的结晶二、酶的结晶l三、酶的干燥三、酶的干燥 一、酶的浓缩l浓缩浓缩是从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而是从低浓度酶液中除去部分的水或其他溶剂而使之成为高浓度溶液的过程使之成为高浓度溶液的过程l抽提液抽提液( (或发酵液或发酵液) )中酶浓度一般都很低,所以在进中酶浓度一般都很低,所以在进行纯化前往往须先予以浓缩,通过浓缩可以提高浓行纯化前往往须先予以浓缩,通过浓缩可以提高浓度、缩小体积,同时酶和蛋白质在浓缩溶液中的稳度、缩小体积,同时酶和蛋白质在浓缩溶液中的稳定性也较高定性也较高l常用的浓缩方法:常用的浓缩方法: 蒸发、超滤、凝胶过滤、沉淀法、渗透蒸发、超滤、凝胶过滤、沉淀法、渗透 二、酶的结晶l结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。

      结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程l酶在结晶之前必须经过纯化达到一定的纯度,通常酶在结晶之前必须经过纯化达到一定的纯度,通常酶的纯度应当在酶的纯度应当在50%以上才能进行结晶总的趋势%以上才能进行结晶总的趋势是酶的纯度越高,越容易进行结晶但是浓度过高是酶的纯度越高,越容易进行结晶但是浓度过高时,会形成许多小晶核,结晶小,不易长大有时时,会形成许多小晶核,结晶小,不易长大有时为了进一步提高晶体的纯度,可以进行重结晶操作为了进一步提高晶体的纯度,可以进行重结晶操作l结晶方法:结晶方法: 盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法等电点结晶法 三、酶的干燥三、酶的干燥l真空干燥真空干燥l冷冻干燥冷冻干燥l喷雾干燥喷雾干燥l气流干燥气流干燥l吸附干燥吸附干燥 6 6、酶制剂的类型、酶制剂的类型l(1)液体酶制剂液体酶制剂 l(2)固体粗酶制剂固体粗酶制剂 l(3)纯酶制剂纯酶制剂 l(4)固定化酶制剂固定化酶制剂 作业作业l名词解释:名词解释: 盐溶、盐析、硫酸铵饱和度、亲和纯化技术盐溶、盐析、硫酸铵饱和度、亲和纯化技术l简答题:简答题:Ø1 1、简要说明酶的分离纯化一般程序。

      简要说明酶的分离纯化一般程序Ø2 2、简述酶分离纯化的基本原则简述酶分离纯化的基本原则Ø3 3、简述酶分离纯化方法的分类及其原理简述酶分离纯化方法的分类及其原理 ★★酶的用途与纯度要求酶的用途与纯度要求用途用途纯度纯度医疗用途、活体研究等医疗用途、活体研究等要求极高纯度要求极高纯度(>99%%)x射线结晶、物理化学性质射线结晶、物理化学性质研究等研究等高纯度高纯度(95%~%~99%%)N末端测序、生产抗原等末端测序、生产抗原等一般纯度一般纯度(<95%%) ★★酶蛋白性质及其对纯化策略的影响酶蛋白性质及其对纯化策略的影响 样品性质对纯化策略的影响温度稳定性迅速,且在低温下操作pH值稳定性选择合适的缓冲液,对离子交换、亲和色谱或反相色谱条件的选择溶解稳定性对反相色谱条件的选择离子强度对沉淀及疏水亲和色谱的条件的选择蛋白酶敏感性需去除蛋白酶或添加抑制剂金属离子敏感性在缓冲液中添加EDTA)或乙二醇双(2-氨基乙基)醚-四乙酸(EGTA)氧化敏感性需添加还原剂分子量对凝胶过滤介质的选择 类型类型孔径孔径推动力推动力机制机制微滤微滤0.02~~10μm0~~1× 105Pa筛分筛分超滤超滤0.001~~0.02μm(相对分子质量(相对分子质量103~~105))0~~1× 105Pa筛分筛分反渗透反渗透无孔无孔(相对分子质量(相对分子质量< 1000))0~~1× 105Pa溶液扩散溶液扩散渗析渗析1~~3nm浓度差浓度差筛分筛分+扩散扩散电渗析电渗析相对分子质量相对分子质量< 200电位差电位差离子迁移离子迁移渗透蒸发渗透蒸发无孔无孔分压差分压差溶液扩散溶液扩散气体分离气体分离无孔无孔0~~1× 105Pa溶液扩散溶液扩散 ★细胞结构与酶分布 。

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