实验七SDS-PAGE测定蛋白质的分.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验七,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质分子量,一、实验目的,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理,掌握垂直板电泳的操作方法,聚丙烯酰胺凝胶是由单体,丙烯酰胺,(,acrylamide,，简称,Acr,),和交联剂,N,N-,甲叉双丙烯酰胺,(,methylene-bisacrylamide,简称,Bis,),在催化剂和加速剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为,聚丙烯酰胺凝胶电泳,(,polyacrylamide,gel electrophoresis,，简称,PAGE,),二、实验原理,SDS,即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，与大多数蛋白质平均结合比为,1.4g SDS/g,蛋白质由于,SDS,带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的,负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。

SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴则与蛋白质的Mr成正比蛋白质分子的迁移速度只取决于分子大小分子量在15KD到200KD之间时，lgMr=K-b*,m,R,浓缩效应,（1）凝胶孔径的不连续性：,在上述凝胶中，浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢因而在两层凝胶交界处，,样品迁移受阻而压缩成很窄的区带,2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：,浓缩胶pH6.8，Tris-Cl 0.5 mol/L；,三羟甲基氨基甲烷,分离胶pH8.8，Tris-Cl 1.5 mol/L,电极缓冲液pH=8.30，为Tirs-Gly缓冲液,浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-低，比Gly高3）电位梯度不连续性：,快离子（Cl-）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。

这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子本来夹在快慢离子之间的蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化由于其,pH,升高,(,电泳进行时常超过,9.0),，使,Gly,解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降此两项变化，使,Gly,的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的,pH,和电压梯度环境中，按其分子的大小移动分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开分子筛效应,在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率净电荷多，则迁移快；反之，则慢SDS-蛋白质复合物电荷密度相同，静电荷量与蛋白质分子量成相关电荷效应,三、实验试剂,低分子量标准蛋白（protein marker）：兔磷酸化酶B MW=94000 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=45000 牛碳酸酐酶 MW=33000 蛋白A MW=26000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20000 鸡蛋清溶菌酶 MW=14400,(1)单体母液 （30%丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合溶液）（2）10%SDS （3）1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 （5）10%过硫酸铵(APS)（现配现用）,作用：提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基,（6）TEMED（四甲基乙二胺）,作用：加速过硫酸铵形成自由基,(7)2,样品缓冲液,SDS,、甘油、巯基乙醇、溴酚兰,(8),2,电极缓冲液母液（pH8.3）Tris，Gly，SDS (9)染色液（考马斯亮蓝染料）(10)脱色液,甲醇、冰醋酸 水溶液,四、实验步骤,1.将玻璃板洗净晾干,准备2个干净的烧杯 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好3.配好分离胶（12ml）,用小烧杯连续平稳加入，至凹槽高度的大约7/10处，之后加0.5cm高正丁醇（,或蒸馏水,），静置50分钟,凝胶配制过程中，TEMED要在注胶前再加入，否则凝结后无法注胶,12%的分离胶（12ml）,胶浓度,12,单体母液（ml）,4.80,去离子水（ml）,4.20,分离胶缓冲液（ml）,3.00,10,APS,（,l,）,50,TEMED(l),18,醇封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。

凝胶聚合好的标志是胶与醇层之间形成清晰的界面4.倒出正丁醇,用去离子水清洗,并用滤纸吸干，配好浓缩胶（5ml），加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约50分钟样梳需一次平稳插入梳口处不得有气泡，梳底需水平5.0%的浓缩胶（5ml）,胶浓度,5,单体母液（,ml,）,0.75,去离子水（,ml,）,3.00,浓缩胶缓冲液（,ml,）,1.25,10,APS,（,l,）,40,TEMED(l),12,5.拔出样梳后，将玻板固定在电泳槽上，加入电极缓冲液，上槽缓冲液液面要高过点样孔，下槽要没过电极6.点样（Marker和待测蛋白样，加入等体积的2,样品缓冲液,）,加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合7.,开始电泳，电压100V，溴酚蓝进入分离胶后改为150V，距凝胶底边约0.5cm时，停止电泳8.,凝胶板剥离与染色 电泳结束后撬开玻板，将凝胶放在大平皿内，加入染色液，染色12-15min剥胶时要小心,保持胶完好无损,9.,脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，再用脱色液脱色,每脱色15min后换一次脱色液，脱色3次五、实验结果分析,绘制标准曲线：,log Mr=K-,b,m,R,蛋白质区带中心至分离胶上沿距离,相对迁移率=,溴酚蓝至分离胶上沿距离,以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。

六、思考题,在SDS-PAGE中，当分离胶加完后，在其上加一层正丁醇的目的是什么?,在SDS-PAGE中分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和APS,试述其作用?,解释浓缩效应和分子筛效应。