蛋白质分离技术(全)ppt课件.ppt

第十第十节节蛋白质蛋白质的分离与纯化的分离与纯化一、一、 引言引言二、二、 蛋白质（酶）分蛋白质（酶）分离纯化的前处理离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离三、蛋白质（酶）分离与纯化与纯化四、层析技术四、层析技术五、电泳技术五、电泳技术六、离心技术六、离心技术一、一、 引言引言•蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子蛋白质是生物非常重要的生物大分子蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能等多种生理功能（一）分离纯化的意义（一）分离纯化的意义①①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义质有重大意义②②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂如用淀粉酶制造葡萄糖、需要大量的高活性的酶制剂。

如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等麦芽糖、糊精以及糖浆等③③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病④④基因工程的需要基因工程的需要（二）分离纯化的要求（二）分离纯化的要求1 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求如作、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求如作为研究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系为研究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一制剂，达到一定纯度即可，不要求均一2 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性3 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失而且提纯步骤越多，损失越大不少损失而且提纯步骤越多，损失越大（三）分离纯化的一般程序（三）分离纯化的一般程序§生物大分子的分离纯化一般可分为生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：以下几个阶段：    ①①材料的选择和预处理材料的选择和预处理    ②②破碎细胞及提取（有时还需要进破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）行细胞器的分离）    ③③分离纯化：包括粗分级分离和细分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离分级分离§其中前两个阶段为生物大分子分离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。

纯化的前处理选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定二、二、 蛋白质（酶）蛋白质（酶） 分离纯化的前处理分离纯化的前处理（一）材料的选择与预处理（一）材料的选择与预处理•选择材料主要根据实验目的而定工业生产上注意选择含选择材料主要根据实验目的而定工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料科研选材则无需考虑上述问题，物组织或微生物做原料科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可只要能达到实验目的即可•实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开另外，必须尽要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理若不立即进行实验可能保持材料的新鲜，尽快加工处理若不立即进行实验或加工，应冷冻保存或加工，应冷冻保存。

（二）细胞的破碎（二）细胞的破碎•分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性因此应选择适当的方来的天然状态，不丢生物活性因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎但若材料是体液（如血）或生法将组织和细胞破碎但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎•组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同•1. 机械法：机械法：•1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆中，加入少量石英砂研磨或匀浆•2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用然后再用10000r/min～～20000r/min的内刀式组的内刀式组织捣碎机织捣碎机(即高速分散器即高速分散器)将组织的细胞打碎。

将组织的细胞打碎2.物理法：物理法：•1) 反反复复冻冻融融法法：：将将待待破破碎碎的的细细胞胞冷冷至至－－15℃到到－－20℃，，然然后后放放于于室室温温(或或40℃)迅迅速速融融化化，，如如此此反反复复冻冻融融多多次次，，由由于于细细胞胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎•2) 超超声声波波处处理理法法：：此此法法是是借借助助超超声声波波的的振振动动力力破破碎碎细细胞胞壁壁和和细胞器破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些•3) 压压榨榨法法：：这这是是一一种种温温和和的的、、彻彻底底破破碎碎细细胞胞的的方方法法在在1000×105Pa～～2000×105Pa 的的高高压压下下使使细细胞胞悬悬液液通通过过一一个个小小孔孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎突然释放至常压，细胞将彻底破碎•4) 冷冷热热交交替替法法：：从从细细菌菌或或病病毒毒中中提提取取蛋蛋白白质质和和核核酸酸时时可可用用此此法法在在90℃左左右右维维持持数数分分钟钟，，立立即即放放入入冰冰浴浴中中使使之之冷冷却却，，如如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎3. 化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：•1) 自自溶溶法法：：将将新新鲜鲜的的生生物物材材料料存存放放于于一一定定的的pH和和适适当当的的温温度度下下，，细细胞胞结结构构在在自自身身所所具具有有的的各各种种水水解解酶酶（（如如蛋蛋白白酶酶和和酯酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来•2) 溶溶胀胀法法：：细细胞胞膜膜为为天天然然的的半半透透膜膜，，在在低低渗渗溶溶液液和和低低浓浓度度的的稀稀盐盐溶溶液液中中，，由由于于存存在在渗渗透透压压差差，，溶溶剂剂分分子子大大量量进进入入细细胞胞，，将细胞膜胀破释放出细胞内含物将细胞膜胀破释放出细胞内含物•  3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于酶和酯酶等，于37℃，，pH8，，处理处理15分钟，可以专一性地将分钟，可以专一性地将细胞壁分解细胞壁分解 •4) 有有机机溶溶剂剂处处理理法法：：利利用用氯氯仿仿、、甲甲苯苯、、丙丙酮酮等等脂脂溶溶性性溶溶剂剂或或SDS（（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠））等等表表面面活活性性剂剂处处理理细细胞胞，，可可将将细细胞胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。

膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用（三）细胞器的分离（三）细胞器的分离•细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体还有叶绿体•如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质•细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等各种细胞组分按质量大小的不同，经檬酸、聚乙二醇等各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分分步离心后，即可获得所需组分（四）提取（四）提取•组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。

物的分解破坏，这就是提取1. 影响提取的因素影响提取的因素•目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；•由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；•溶剂的溶剂的pHpH值和提取时间等值和提取时间等通常：通常： 极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；• 温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大；• 远离等电点的远离等电点的pHpH值，溶解度增加值，溶解度增加提提取取时时所所选选择择的的条条件件应应有有利利于于目目的的产产物物溶溶解解度度的的增增加加和和保保持持其生物活性其生物活性2. 水溶液提取水溶液提取•蛋蛋白白质质和和酶酶的的提提取取一一般般以以水水溶溶液液为为主主用用水水溶溶液液提提取取生生物物大大分分子子应应注注意的几个主要影响因素是：意的几个主要影响因素是：•    1) 盐浓度（即离子强度）：盐浓度（即离子强度）：•离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶，离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶盐溶”现象。

盐溶现现象盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果•为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性向水溶液中加为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、、NaCl、、NH4Cl或或(NH4)2SO4））可以增加溶液的极性可以增加溶液的极性•2) pH值：值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有值有关过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在关过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～～8范围内，提取溶剂的范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧范围内，通常选择偏离等电点的两侧 •3) 温度：温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在质和酶，提取时一般在0℃～～5℃的低温操作。

的低温操作 • 4) 防止蛋白酶的降解作用：防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提加入抑制剂或调节提取液的取液的pH、、离子强度或极性等方法使相应的水解离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降解作用 •5) 搅搅拌拌与与氧氧化化：：搅搅拌拌能能促促使使被被提提取取物物的的溶溶解解，，一一般般采采用用温温和和搅搅拌拌为为宜宜，，速速度度太太快快容容易易产产生生大大量量泡泡沫沫，，增增大大了了与与空空气气的的接接触触面面，，会会引引起起酶酶等等物物质质的的变变性性失失活活因因为为一一般般蛋蛋白白质质都都含含有有相相当当数数量量的的巯巯基基，，有有些些巯巯基基常常常常是是活活性性部部位位的的必必需需基基团团，，若若提提取取液液中中有有氧氧化化剂剂或或与与空空气气中中的的氧氧气气接接触触过过多多都都会会使使巯巯基基氧氧化化为为分分子子内内或或分分子子间间的的二二硫硫键键，，导导致致酶酶活活性性的的丧丧失失在在提提取取液液中中加加入入少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化3. 有机溶剂提取有机溶剂提取•       一一些些和和脂脂类类结结合合比比较较牢牢固固或或分分子子中中非非极极性性侧侧链链较较多多的的蛋蛋白白质质和和酶酶难难溶溶于于水水、、稀稀盐盐、、稀稀酸酸、、或或稀稀碱碱中中，，常常用不同比例的有机溶剂提取。

用不同比例的有机溶剂提取•      常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性和亲脂性•      有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用兼有除去杂质提高纯化效果的作用          例如，胰岛素例如，胰岛素   4. 膜蛋白的提取•膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能非常重要的生物学功能 •根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白1) 外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜溶解后才可分离出来使膜溶解后才可分离出来 •膜蛋白膜蛋白 即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本方法就是用基本方法就是用不同的离心速度不同的离心速度去掉胞质蛋白去掉胞质蛋白等，最后用等，最后用去污剂去污剂把蛋白从膜中释放出来把蛋白从膜中释放出来•膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，Triton-100，，Tween-80, SDS等表面活性剂等表面活性剂 分离膜蛋白的方法（原则性）  •1）） 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分心得到含有膜蛋白的粗组分。

 •2 ）用特殊的去污剂选择性的分离在多数情）用特殊的去污剂选择性的分离在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来中溶解下来三、分离与纯化三、分离与纯化•从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行•蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的解度，电荷等建立起来的常用的蛋白质分离纯化技术常用的蛋白质分离纯化技术溶解度溶解度盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀分子大小分子大小透析、超过滤透析、超过滤密度梯度离心、凝密度梯度离心、凝胶过滤胶过滤带电特性带电特性电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析吸附特性吸附特性吸附层析吸附层析对配体分子对配体分子的亲和性的亲和性依据性质依据性质方方      法法用于粗分用于粗分用于细分用于细分亲和层析亲和层析、金属、金属螯合层析螯合层析分配层析分配层析（一）粗分级分离（一）粗分级分离§主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。

蛋白分开§优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质又能浓缩蛋白质§缺点：分辨率低，产品杂质多缺点：分辨率低，产品杂质多1. 1. 盐析（盐析（中性盐沉淀中性盐沉淀））•在在溶溶液液中中加加入入中中性性盐盐使使生生物物大大分分子子沉沉淀淀析析出出的的过过程程称称为为“盐盐析析”除除了了蛋蛋白白质质和和酶酶以以外外，，多多肽肽、、多多糖糖和和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离•    盐盐析析法法应应用用最最广广的的还还是是在在蛋蛋白白质质领领域域，，已已有有八八十十多年的历史，其突出的优点是：多年的历史，其突出的优点是：•    ①①成本低，不需要特别昂贵的设备成本低，不需要特别昂贵的设备•    ②②操作简单、安全操作简单、安全•    ③③对许多生物活性物质具有稳定作用对许多生物活性物质具有稳定作用⑴⑴ 盐析的基本原理盐析的基本原理•蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷化膜和电荷•中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。

•加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉淀溶溶解解度度盐浓度盐浓度Salting-outSalting-in+ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + +等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质蛋白质聚集聚集沉淀沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱+ + + ++ + + +水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）水化膜水化膜⑵⑵ 中性盐的选择中性盐的选择•常常用用的的中中性性盐盐中中最最重重要要的的是是(NH4)2SO4，，因因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：•    1) 溶溶解解度度大大：：尤尤其其是是在在低低温温时时仍仍有有相相当当高高的的溶溶解解度度，，这这是是其其他他盐盐类类所所不不具具备备的的。

由由于于酶酶和和各各种种蛋蛋白白质质通通常常是是在在低低温温下下稳稳定定，，因因而而盐盐析析操操作作也也要要求求在在低低温温下下（（0～～4℃））进进行行由由下下表表可可以以看看到到，， 硫硫铵铵在在0℃时时的的溶溶解解度度，，远远高于其它盐类：远远高于其它盐类：几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水）•                       0℃        20℃          80℃        100 ℃（NH4)2SO4     70.6        75.4          95.3          103     Na2SO4         4.9         18.9          43.3           42.2    NaH2PO4       1.6           7.8          93.8           101•硫铵在硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类时的溶解度，远远高于其它盐类•2) 分分离离效效果果好好：：有有的的提提取取液液加加入入适适量量硫硫酸酸铵铵盐盐析析，，一一步步就就可可以以除除去去75％％的的杂杂蛋蛋白白，，纯纯度度提高了四倍。

提高了四倍• 3) 不不易易引引起起变变性性，，有有稳稳定定酶酶与与蛋蛋白白质质结结构构的的作作用用有有的的酶酶或或蛋蛋白白质质用用2～～3mol/L浓度度的的(NH4)2SO4保存可达数年之久保存可达数年之久• 4) 价格便宜，废液不污染环境价格便宜，废液不污染环境（（3 3）分段盐析）分段盐析•不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质溶液中析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质溶液中的盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀的盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出饱和度：饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度分数表示的盐浓度（4）盐析的影响因素）盐析的影响因素•1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。

低浓度的蛋白蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低较适中的蛋白质浓度是质，共沉淀作用小，但回收率降低较适中的蛋白质浓度是2.5％～％～3.0％，相当于％，相当于25 mg/mL～～30mg/mL•2) pH值值对对盐盐析析的的影影响响：：在在等等电电点点处处溶溶解解度度小小，，pH值值常常选选在在该该蛋蛋白白质的等电点附近质的等电点附近•3) 温温度度的的影影响响：：对对于于蛋蛋白白质质、、酶酶和和多多肽肽等等生生物物大大分分子子，，在在高高离离子子强强度度溶溶液液中中，，温温度度升升高高，，它它们们的的溶溶解解度度反反而而减减小小在在低低离离子子强强度度溶溶液液或或纯纯水水中中蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度大大多多数数还还是是随随温温度度升升高高而而增增加加的的一一般般情情况况下下，，可可在在室室温温下下进进行行但但对对于于某某些些对对温温度度敏敏感感的的酶酶，，要要求求在在0℃～～4℃下操作，以避免活力丧失下操作，以避免活力丧失 2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法•⑴⑴基本原理基本原理•    有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。

其原理主要是：都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一其原理主要是：•    ①①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀•    ②②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时，从蛋由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时，从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用因而发生沉淀作用（（2）有机溶剂沉淀法的优点）有机溶剂沉淀法的优点•①①分分辨辨能能力力比比盐盐析析法法高高，，即即一一种种蛋蛋白白质质或或其其他他溶溶质质只只在在一一个个比比较较窄窄的的有有机机溶溶剂剂浓浓度度范范围围内内沉沉淀•②②沉沉淀淀不不用用脱脱盐盐，，过过滤滤比比较较容容易易（（如如有有必必要要，，可可用用透透析析袋袋脱脱有有机机溶溶剂剂））。

因因而而在在生生化化制制备备中中有广泛的应用有广泛的应用•其其缺缺点点是是对对某某些些具具有有生生物物活活性性的的大大分分子子容容易易引引起变性失活，操作需在低温下进行起变性失活，操作需在低温下进行（（3）有机溶剂的选择和浓度的计算）有机溶剂的选择和浓度的计算    用用于于生生化化制制备备的的有有机机溶溶剂剂的的选选择择首首先先是是要要能能与与水水互互溶溶沉沉淀淀蛋蛋白白质质和和酶酶常常用用的的是是乙乙醇醇、、甲甲醇醇和丙酮•    为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀（（4）有机溶剂沉淀的影响因素）有机溶剂沉淀的影响因素    1) 温温度度：：多多数数生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、、酶酶和和核核酸酸在在有有机机溶溶剂剂中中对对温温度度特特别别敏敏感感，，温温度度稍稍高高就就会会引引起起变变性性，，且且有有机机溶溶剂剂与与水水混混合合时时产产生生放放热热反反应应，，因因此此必必须须预预冷冷，，操操作作要要在在冰冰盐盐浴浴中中进进行行，，加加入入有有机机溶溶剂剂时时必必须须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。

缓慢且不断搅拌以免局部过浓•    一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高   • 2) 样样品品浓浓度度：：低低浓浓度度样样品品回回收收率率低低，，要要使使用用比比例例更更大大的的有有机机溶溶剂剂进进行行沉沉淀淀高高浓浓度度样样品品，，可可以以节节省省有有机机溶溶剂剂，，减减少少变变性性的的危危险险，，但但杂杂蛋蛋白白的的共共沉沉淀淀作作用用大•通常使用通常使用5mg/mL～～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜的蛋白质初浓度为宜   •3) pH值值：：选选择择在在样样品品稳稳定定的的pH值值范范围围内内，，通通常常是是选选在在等等电电点点附附近近，，从从而而提提高高此此沉沉淀淀法法的的分分辨辨能能力•4) 离离子子强强度度：：盐盐浓浓度度太太大大或或太太小小都都有有不不利利影影响响，，通通常常盐盐浓浓度度以以不不超超过过5％％为为宜宜，，使使用用乙乙醇醇的的量量也也以以不不超超过过原原蛋蛋白白质质水水溶溶液液的的２２倍倍体体积积为为宜宜，，少少量量的的中中性性盐盐对对蛋蛋白白质质变变性性有有良良好好的的保保护护作作用用，，但但盐盐浓浓度度过过高高会会增增加加蛋蛋白白质质在在水水中中的的溶溶解解度度，，降降低低了了沉沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。

淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质•    沉沉淀淀所所得得的的固固体体样样品品，，如如果果不不是是立立即即溶溶解解进进行行下下一一步步的的分分离离，，则则应应尽尽可可能能抽抽干干沉沉淀淀，，减减少少其其中中有有机机溶溶剂剂的的含含量量，，如如若若必必要要可可以以装装透透析析袋袋透透析析脱脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性有机溶剂，以免影响样品的生物活性3.等电点沉淀法等电点沉淀法•利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离利用此法进行初步的沉淀分离•由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，此全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。

配合使用，以提高沉淀能力和分离效果pH和离子强度对和离子强度对β-乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响4. 选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法•这这一一方方法法是是利利用用生生物物大大分分子子与与非非目目的的生生物物大大分分子子在在物物理理化化学学性性质质等等方方面面的的差差异异，，选选择择一一定定的的条条件件使使杂杂蛋蛋白白等等非非目目的的物物变变性性沉沉淀而得到分离提纯淀而得到分离提纯•    ⑴⑴ 热变性热变性•    利利用用生生物物大大分分子子对对热热的的稳稳定定性性不不同同，，加加热热升升高高温温度度使使非非目目的的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中•    ⑵⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性•使使那那些些对对表表面面活活性性剂剂和和有有机机溶溶剂剂敏敏感感性性强强的的杂杂蛋蛋白白变变性性沉沉淀淀通常在冰浴或冷室中进行通常在冰浴或冷室中进行•    ⑶⑶ 选择性酸碱变性选择性酸碱变性•    利利用用对对pH值值的的稳稳定定性性不不同同而而使使杂杂蛋蛋白白变变性性沉沉淀淀通通常常是是在在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。

分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤5. 有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法•有有机机聚聚合合物物是是六六十十年年代代发发展展起起来来的的一一类类重重要要的的沉沉淀淀剂剂，，最最早早应应用用于于提提纯纯免免疫疫球球蛋蛋白白和和沉沉淀淀一一些些细细菌菌和和病病毒毒近近年年来来广广泛泛用于核酸和酶的纯化其中应用最多的是用于核酸和酶的纯化其中应用最多的是     “聚聚 乙乙 二二 醇醇 ”【【 HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH  (n  ＞＞ 4)】】 ( Polyethylene Glycol 简简写写为为 PEG )，，它它的的亲亲水水性性强强，，溶溶干干水水和和许许多多有有机机溶溶剂剂，，对对热热稳稳定定，，有有广广泛泛围围的的分分子子量量，，在在生生物物大大分子制备中，用的较多的是分子量为分子制备中，用的较多的是分子量为6000～～20000的的 PEG•    本方法的优点是：本方法的优点是：•①① 操作条件温和，不易引起生物大分子变性操作条件温和，不易引起生物大分子变性•②② 沉沉淀淀效效能能高高，，使使用用很很少少量量的的PEG即即可可以以沉沉淀淀相相当当多多的的生生物大分子。

物大分子•③③ 沉淀后有机聚合物容易去除沉淀后有机聚合物容易去除6. 透析透析•自自Thomas Graham 1861年年发发明明透透析析方方法法至至今今已已有有一一百百多多年年透透析析已已成成为为生生物物化化学学实实验验室室最最简简便便最最常常用用的的分分离离纯纯化化技技术术之之一一在在生生物物大大分分子子的的制制备备过过程程中中，，除除盐盐、、除除少少量量有有机机溶溶剂剂、、除除去去生生物物小小分分子子杂杂质质和和浓浓缩缩样样品品等等都都要用到透析的技术要用到透析的技术•    透析只需要使用专用的半透膜即可完成透析只需要使用专用的半透膜即可完成•保留在透析袋内未透保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为析出的样品溶液称为“保留液保留液”，袋（膜），袋（膜）外的溶液称为外的溶液称为“渗出渗出液液”或或“透析液透析液”截留分子量留分子量MwCO通通常为常为1万左右•    用用1％％  BaCl2检检查查(NH4)2SO4，， 用用 1％％  AgNO3  检检查查NaCl、、KCl等7. 超滤超滤•超超过过滤滤即即超超滤滤，，自自20年年代代问问世世后后，，直直至至60年年代代以以来来发发展展迅迅速速，，很很快快由由实实验验室室规规模模的的分分离离手手段段发发展展成重要的工业单元操作技术。

成重要的工业单元操作技术•超超滤滤现现已已成成为为一一种种重重要要的的生生化化实实验验技技术术，，广广泛泛用用于于含含有有各各种种小小分分子子溶溶质质的的各各种种生生物物大大分分子子（（如如蛋蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化•超超滤滤是是一一种种加加压压膜膜分分离离技技术术，，即即在在一一定定的的压压力力下下，，使使小小分分子子溶溶质质和和溶溶剂剂穿穿过过一一定定孔孔径径的的特特制制的的薄薄膜膜，，而而使使大大分分子子溶溶质质不不能能透透过过，，留留在在膜膜的的一一边边，，从从而而使大分子物质得到了部分的纯化使大分子物质得到了部分的纯化加压的蛋加压的蛋白质溶液白质溶液浓缩的蛋白浓缩的蛋白质溶液质溶液含小分子含小分子的溶液的溶液•超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种微孔过滤、超滤和反渗透三种•    微孔过滤所用的操作压通常小于微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，，膜的膜的平均孔径为平均孔径为500埃～埃～14微米（微米（1微米＝微米＝104埃），埃），用用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。

于分离较大的微粒、细菌和污染物等•    超滤所用操作压为超滤所用操作压为4×104Pa～～7×105Pa，，膜的平膜的平均孔径为均孔径为10—100埃埃，用于分离大分子溶质用于分离大分子溶质•    反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～～140×105Pa，，膜的平均孔径最小，一般为膜的平均孔径最小，一般为10埃埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等制高纯水等（二）精分级分离（二）精分级分离一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去进一步提纯，通常使用高分辨大部分被除去进一步提纯，通常使用高分辨率的率的柱层析及电泳柱层析及电泳方法•常用的柱层析方法有常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析析、疏水吸附层析、亲和层析和和金属螯合层析金属螯合层析等•常用的电泳方法有常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳聚焦电泳等•另外，另外，结晶结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。

制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用第十第十节节蛋白质蛋白质的分离与纯化的分离与纯化一、一、 引言引言二、二、 蛋白质（酶）分蛋白质（酶）分离纯化的前处理离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离三、蛋白质（酶）分离与纯化与纯化四、层析技术四、层析技术五、电泳技术五、电泳技术六、离心技术六、离心技术四、层析技术四、层析技术•层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Michael TswettTswett发现并命名的他将植物叶子的色素通过装填发现并命名的他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法”（（Chromatography) Chromatography) •后来无色物质也可利用吸附柱层析分离后来无色物质也可利用吸附柱层析分离•19441944年出现纸层析年出现纸层析•以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。

层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等（一）层析的分类（一）层析的分类•按层析的分离机理分类按层析的分离机理分类•排阻层析排阻层析(exclusion chromatography)•离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)•吸附层析吸附层析( (absorption chromatography)absorption chromatography)•分配层析分配层析( (partition chromatography)partition chromatography)•亲和层析亲和层析(affinity chromatography)•金属螯合层析金属螯合层析(metal chelating chromatography)•疏水层析疏水层析(hydrophobic chromatography)•反向层析反向层析(reverse phase chromatography)•聚焦层析聚焦层析(focusing chromatography)•灌注层析灌注层析(perfusion chromatography)（二）排阻层析（二）排阻层析 （凝胶层析）（凝胶层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。

析分离的方法，均称之为排阻层析用于层析的分离介质称为排阻层析介质用于层析的分离介质称为排阻层析介质凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药的研究和生产中必不可少的分离介质的研究和生产中必不可少的分离介质 1、凝胶层析的特点及应用、凝胶层析的特点及应用•特点：设备简单、操作方便、样品回收特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点品生物学活性等优点•用途：蛋白质用途：蛋白质(包括酶包括酶)、核酸、多糖等生、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等2、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。

具有立体网状结构，形成很多孔穴概念（概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术原理：原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来3. 3. 凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质(1)(1)交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（SephadexSephadex) ) 1) 1) SephadexSephadex G G G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍。

倍 G G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围 2 2）） SephadeXSephadeX LH LH—2020，，是是SephadexSephadex G G—2525的羧丙基衍生物，溶于的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质2)(2)琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose ; ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Radpharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad) ) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集3)(3)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成交联剂越多，孔隙度越小交联剂越多，孔隙度越小 商品名为生物胶商品名为生物胶—P P（（BioBio-Gel P).-Gel P).(4)(4) 聚丙乙烯凝胶（聚丙乙烯凝胶（StyrogelStyrogel) ) 大网孔结构。

大网孔结构葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性的物理特性品    名干胶颗粒直径/μm得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量／Da线性葡聚糖分子质量/Da20℃lOO℃Sephadex G-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)Sephadex G-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗超细40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-200000725981(10)4. 层析层析柱的重要参数柱的重要参数 •⑴⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。

在色谱柱中充满凝板到凝胶沉积表面的体积在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床床”体体积，常用积，常用Vt 表示 ⑵⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示 •⑶⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用体积，又称定相体积，常用Vi表示 不包括固体支持物不包括固体支持物的体积（的体积（Vg） ⑷⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用的体积，常用Ve 表示•当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为积为Ve 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。

当样品很体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）的弯曲点（或半高处） 洗脱体积洗脱体积5. 5. 凝胶过滤在试验室中的应用凝胶过滤在试验室中的应用1）生物大分子物质的分离纯化生物大分子物质的分离纯化2 2）分子量的测定）分子量的测定3 3）分级分离）分级分离4 4）溶液浓缩）溶液浓缩5 5）平衡常数的测定）平衡常数的测定6 6）细胞及颗粒的分离）细胞及颗粒的分离6. 6. 分子量的测定分子量的测定§蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关量有关:LogMLogM=k=k1 1-k-k2 2VeVe （（VeVe为洗脱体积）为洗脱体积）先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，，并以其分子量对数对并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，，查标准曲查标准曲线即可确定分子量线即可确定分子量LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测（三）离子交换层析（三）离子交换层析•根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲亲和力和力不同而达到分离的目的。

不同而达到分离的目的§离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团分子中含有可解离的基团§含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出可解离出H H+ +；；§含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出可解离出OHOH- -1.离子交换层析的原理离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷排列方式子大小及电荷排列方式 当在一定当在一定pHpH下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键下净电荷为负的蛋白质分子可通过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；结合到带正电荷的阴离子交换剂上； 当在一定当在一定pHpH下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电下净电荷为正的蛋白质分子可通过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；键结合到带负电荷的阳离子交换剂上； 大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子强度或( (和和) )pHpH使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来。

使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来2. 离子交换层析的应用离子交换层析的应用1)1)水处理水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面2)2)分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质 离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化例如对氨基酸的分析使用强酸性抗生素等小分子物质的分离纯化例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pHpH值为值为2 2～～3 3上柱这时氨上柱这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和pHpH值，这样值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定全自各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。

全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成3)3)分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段种重要手段 由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结合使用 使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果交换层析可以得到较满意的分离效果（四）吸附层析(absorption chromatography)•吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓集在其表面的现象集在其表面的现象。

•利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析法，称之为吸附层析•固定相为固体，流动相为液体固定相为固体，流动相为液体•物物质质之之所所以以能能在在固固体体表表面面停停留留，，这这是是因因为为固固体体表表面面的的分分子子和和固固体体内内部部分分子子所所受受的的吸吸引引力力不不同同在在固固体体内内部部，，分分子子之之间间互互相相作作用用的的力力是是对对称称的的，，其其力力场场互互相相抵抵消消而而处处于于固固体体表表明明的的分分子子所所收收的的力力是是不不对对称称的的，，向向内内的的一一面面受受到到固固体体内内部部分分子子的的作作用用力力大大，，而而表表面面层层所所受受的的作作用用力力小小，，因因而而气气体体或或溶溶质质分分子子在在运运动动中中遇遇到到固固体体表表面面时时受受到到这这种种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来剩余力的影响，就会被吸引而停留下来•吸吸附附过过程程是是可可逆逆的的，，被被吸吸附附物物在在一一定定条条件件下下可可以以解解吸吸出出来来。

在在单单位位时时间间内内被被吸吸附附于于吸吸附附剂剂的的某某一一表表面面积积上上的的分分子子和和同同一一单单位位时时间间内内离离开开此此表表面面的的分分子子之之间间可可以以建建立立动动态平衡，称为吸附平衡态平衡，称为吸附平衡•吸吸附附层层析析过过程程就就是是不不断断地地产产生生平平衡衡和和不不平平衡衡、、吸吸附附与与解解吸的动态平衡过程吸的动态平衡过程•实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉•常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物•吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物性不强的有机物 （五）分配层析(partition chromatography)•分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的同而达到分离目的的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。

溶剂抽提方法 •在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）此类溶剂能和多孔的支持物甲醇等）此类溶剂能和多孔的支持物(常用的是吸附常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等等)紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的紧密结合，使呈不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂有机溶剂 •分配系数分配系数( (αα) )是指在一定温度和压力条是指在一定温度和压力条件下达到平衡，物质在固定相和流动相件下达到平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值两部分的浓度比值 分配系数（分配系数（αα）＝）＝物质在固定相中的浓度物质在固定相中的浓度 物质在流动相中的浓度物质在流动相中的浓度•在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动当经过前方固定相时，流动相中的溶向前移动当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相通过这样质就会进行分配，一部分进入固定相。

通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进各种溶质由于分配系数不同，向前移动断前进各种溶质由于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同分配系数较大的物质，由于的速度也各不相同分配系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快从而将分配系数不同的物质分离开来从而将分配系数不同的物质分离开来（六）（六）亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography) •许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞的特性例如：酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，争性抑制剂等），抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核细胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。

蛋白（或凝集素）等 1. 亲和层析的原理•亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质则被冲洗出去然后再用留在柱上，其他物质则被冲洗出去然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离提纯的目的脱下来，从而达到分离提纯的目的 配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体2. 亲和层析的特点•纯化效率极高：亲和层析由于配体与待纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合，所以分离提分离物质进行特异性结合，所以分离提纯的效率极高，提纯度可达几千倍纯的效率极高，提纯度可达几千倍 。

3. 亲和层析的应用•1）） 抗原和抗体抗原和抗体  利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析例如将抗原分离的方法又称为免疫亲和层析例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体其对应的抗体•抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为为10–8 - 10–12 M，，所以洗脱时是比较困难的，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件通常需要较强烈的洗脱条件•2) 激素和受体蛋白激素和受体蛋白  激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离但去污剂溶解通常不影响受常的层析技术分离但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合所以利用激素和受体蛋白与其对应激素的结合所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（体蛋白间的高亲和力（10-6－－10–12 M））而进行亲而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。

目前已经用和层析是分离受体蛋白的重要方法目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体多种激素的受体3) 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白  凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖取它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞•用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法        伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A能结合含能结合含α-D-吡喃甘露糖苷或吡喃甘露糖苷或α -D-吡喃葡萄吡喃葡萄糖苷的糖蛋白糖苷的糖蛋白        麦胚凝集素可以特异的与麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、、红细胞膜凝集素受体等的红细胞膜凝集素受体等的分离。

分离洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来洗脱下来4）多核苷酸和核酸）多核苷酸和核酸  利用利用poly-U作为配体可以用于分离作为配体可以用于分离mRNA以及各种以及各种poly-U结合蛋白结合蛋白poly-A可以用于分离可以用于分离RNA聚合酶以及其它聚合酶以及其它poly-A结合蛋白结合蛋白•以以DNA作为配体可以用于分离各种作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、结合蛋白、DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类聚合酶、核酸外切酶等多种酶类5）辅酶）辅酶  核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化进行分离纯化例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、、cAMP、、ADP、、ATP、、CoA、、NAD+、、NADP+等等应用很广泛，可等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶以用于分离各种激酶和脱氢酶。

6）分离病毒、细胞）分离病毒、细胞  利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离细胞的分离         例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等（七）金属螯合层析（七）金属螯合层析(metal chelating chromatography)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析离的方法，称之为金属螯合层析金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分离于表达蛋白的分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein▁▁▁▁▁▁▂▃▄▂▃▄▅▅▆▆▇▇▇▇▆▆▅▅▄▄▃▃▂▂▁▁▁▁▁▁▁▁▂▃▄▂▃▄▅▅▆▆▇▇▇▇▆▆▅▅▄▄▃▃▂▂▁▁（八）高效液相色谱（八）高效液相色谱（（ HPLC HPLC ））•高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。

高效固定相的柱色谱分离技术•高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足•目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而，而80%则需用高效液相色谱来分析则需用高效液相色谱来分析1. 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速     高沸点、热不稳定有机及生化试样高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法的高效分离分析方法2. 液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流程主要部件主要部件(1) 高压输液泵高压输液泵©主主要要部部件件之之一一，，压压力力：：150～～350×105 Pa©为为了了获获得得高高柱柱效效而而使使用用粒粒度度很很小小的的固固定定相相（（<10μm）），，液液体体的的流流动动相相高高速速通通过过时时，，将将产产生生很很高高的的压压力力，，因因此此高高压压、、高高速速是是高高效效液液相相色色谱谱的的特点之一。

特点之一(2) 梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:              利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱内梯度内梯度:        一台高压泵一台高压泵, 通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同极性将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合(3) 进样装置进样装置流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，   通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，   其结构如图所示：其结构如图所示：(4) 高效分离柱高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径1～～6 mm，，柱长柱长5～～40 cm发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效(5) 高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器紫外光度检测器（紫外光度检测器（UV）：）：最小检测量最小检测量10-9g·mL-1，，对流量对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。

和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱        最常用的检测器最常用的检测器光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：：1024个个二二极极管管阵阵列列，，各各检检测测特特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示3. 影响分离的因素影响分离的因素•影响分离的主要因素有影响分离的主要因素有:         固定相及分离柱；固定相及分离柱；         流动相的流量、性质和极性流动相的流量、性质和极性;         1）固定相及分离柱）固定相及分离柱选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备常高的工作，一般很少自行制备        选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高分析速度；        研制高效柱填料是一活跃领域研制高效柱填料是一活跃领域2）流动相及流动相的极性）流动相及流动相的极性（（1））可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。

 液液相相色色谱谱的的流流动动相相又又称称为为：：淋洗液，洗脱剂淋洗液，洗脱剂2））亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的的极极性性，，称称为为正正相相液液液液色色谱谱法法，，极性柱也称正相柱极性柱也称正相柱3））若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱组组分分在在两两种种类型分离柱上的出峰顺序相反类型分离柱上的出峰顺序相反 流动相组成流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；     按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；     按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂常用溶剂:      己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水    采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。

相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间4. 高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型1 1）吸附色谱（液）吸附色谱（液- -固吸附色谱）固吸附色谱）         以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，，如如硅硅胶胶、、氧氧化化铝铝等等，，较较常常使使用用的的是是5～～10μm的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂流流动动相相可可以以是是各各种种不同极性的一元或多元溶剂不同极性的一元或多元溶剂2 2）分配色谱（液）分配色谱（液- -液分配色谱）液分配色谱）         早早期期通通过过在在担担体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相,   现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，，即即用用化化学学反反应应的的方方法法通通过过化化学键将固定液结合在担体表面学键将固定液结合在担体表面3 3）离子交换色谱）离子交换色谱             固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上上的的交交换换基基团团的交换能力的不同而得到分离的交换能力的不同而得到分离。

4 4）凝胶色谱（空间排阻色谱））凝胶色谱（空间排阻色谱）          以以凝凝胶胶为为固固定定相相凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、、琼琼脂脂糖糖等等软软质质凝凝胶胶；；多多孔孔硅硅胶胶、、聚聚苯苯乙乙烯烯凝凝胶胶等等硬质凝胶；硬质凝胶；五、电泳技术•电泳的概念电泳的概念：：带电物质在电场中向相反电极移带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（动的现象称为电泳（electrophoresiselectrophoresis）•电泳现象早在十九世纪初就已发现（电泳现象早在十九世纪初就已发现（18081808年俄年俄国物理学家国物理学家ReReŭssss进行了世界上第一次电泳实进行了世界上第一次电泳实验验）但电泳技术的广泛应用，则是在）但电泳技术的广泛应用，则是在19371937年年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。

学、免疫学等领域得到了广泛应用电泳技术发展简史•  1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象  1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点   •1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖  1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究•1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法•  1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。

•30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”•80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视和应用（一）电泳的分类（一）电泳的分类原则上按电泳的原理来分，可分为二类：原则上按电泳的原理来分，可分为二类：•自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳其装置复杂，有支持介质的溶液中进行的电泳其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用价格昂贵，费时费力，不便于推广应用•区带电泳：区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带支持介质的质在支持介质上分离成若干区带支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。

区带使被分离的成分得到最大分辨率的分离区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型又可分为不同的类型•按支持介质种类的不同，区带电泳可分按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：为：①①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析核苷酸的定性定量分析②②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高 v以上二种类型的电泳，由于介质的孔以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离分离物的电荷多少进行分离③③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）天然淀粉经可一层一层剥层分析（一板多测）天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。

低，实验室中已很少使用④④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析琼琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应的分子筛效应⑤⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测其分辨率较高离、纯化及检测其分辨率较高v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质持介质（二）电泳的基本原理（二）电泳的基本原理§电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的速度不同进而达到分离目的若将带净电荷若将带净电荷Q Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为：的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F F引引= = E Q E Q （1）在溶液中在溶液中, ,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻阻 F F阻阻= 6= 6ππr rηV V 当当F F引引= =F F阻阻时时 EQ = 6EQ = 6ππr rηV V V = V = 由上式可以看出由上式可以看出, ,粒子的移动速度粒子的移动速度( (泳动速度泳动速度V)V)与电场强度与电场强度( (E)E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量( (Q)Q)成正比成正比, ,而与粒子的半径而与粒子的半径( (r)r)及溶液的粘度及溶液的粘度( (η) )成反比。

成反比非球形分子（如线状非球形分子（如线状DNADNA））在电泳过程中受到更大在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关EQEQ6 6ππr rη（2）（3）（4） 由由（4 4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同 在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便于比较，于比较，常用迁移率常用迁移率 m m（（或称泳动度，指带电粒子在或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子代替泳动速度表示粒子的泳动情况的泳动情况 m = V/E = Q/6m = V/E = Q/6ππr rη （5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，在同一电场中，在同一电场中，迁移率仅与球形粒迁移率仅与球形粒子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。

场强度无关EQEQ6 6ππr rη（4）V= 以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情以上讨论的是在溶液中进行的自由界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响因素外，有效迁移率还受有效迁移率还受电渗电渗（是指在电场中，液体对于固体（是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动）的影响电泳时应避免用高电渗支持物的相对移动）的影响电泳时应避免用高电渗物质作支持介质物质作支持介质 最后要考虑选用最后要考虑选用离子强度离子强度适宜的溶液离子强度适宜的溶液离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越液中的离子会分担大部分电流，则粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快小，泳动速度越慢，反之越快 总之，电泳受总之，电泳受粒子本身大小、形状、所带电量粒子本身大小、形状、所带电量、、溶液粘度、温度、溶液粘度、温度、pHpH、、电渗及离子强度电渗及离子强度多种因素的影多种因素的影响。

响（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，，PAGE））是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，介质的一种电泳方法聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对有弹性，透明，化学性质稳定，对pHpH和温度变化小，没有和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，，简称简称Acr））和交联剂和交联剂N N，，N N’- -甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，，简称简称Bis））在催化剂作用下合成的在催化剂作用下合成的 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。

丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N’-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH     C=O     NH     CH2     NH     C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH     C=O     NH     CH2     NH     C=O CH2-CHCH2¯  CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH(            )n(            )n(            )m(            )m1. 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种：  1.化学聚合化学聚合  化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用过硫酸铵过硫酸铵（（ammonium persulfate，，Ap），），此外还需要加速剂此外还需要加速剂TEMED（（N，，N，，N’，，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。

微量式存在微量TEMED的加入，可促使过硫酸铵形成自由的加入，可促使过硫酸铵形成自由基：基：            S2O82-             2•SO4-  这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺2.2.光聚合光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应TEMEDTEMED的存在，可以加速聚合的存在，可以加速聚合 上述聚合反应受许多因素的影响：上述聚合反应受许多因素的影响： （（1 1））大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，中溶解的空气在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。

隔绝空气，可加速聚合 （（2 2））低温、低低温、低pHpH都会减慢聚合反应速度都会减慢聚合反应速度 （（3 3））有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应可抑制聚合反应2. 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（取决于凝胶总浓度（T T））和和AcrAcr与与BisBis两者之比凝胶总两者之比凝胶总浓度（浓度（T T））和交联度（和交联度（C C））的计算公式分别为：的计算公式分别为：Acr（（g））+Bis（（g））Bis（（g））X100%C =Acr（（g））+Bis（（g））V（（ml））X100%T =凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响凝胶浓度越大，凝胶浓度越大，孔径越小孔径越小凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断浓度过小，凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂凝胶稀软，不易操作，也易断裂当凝胶浓度确定后，交当凝胶浓度确定后，交联度为联度为5%5%时，凝胶具有最小孔径，时，凝胶具有最小孔径，超过超过5%5%或低于或低于5%5%时凝胶时凝胶孔径都要增大。

孔径都要增大 在浓度为在浓度为7.5%7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果因此，把浓度为质能得到满意的分离效果因此，把浓度为7.5%7.5% 凝胶称为标准胶凝胶称为标准胶对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%7.5%的标准胶或的标准胶或4%-10%4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度用于研究大分子核酸的凝胶多为用于研究大分子核酸的凝胶多为2.4%2.4%的大孔凝胶，的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可加入此时凝胶太软，不易操作，可加入0.5%0.5%琼脂糖，琼脂糖，或在或在3%3%凝胶中加入凝胶中加入20%20%蔗糖以增加机械强度而蔗糖以增加机械强度而又不影响凝胶孔径大小又不影响凝胶孔径大小3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：   1））凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶（上层为大孔径的浓缩胶（2~3％），下层为小孔径的分％），下层为小孔径的分离胶（离胶（ 5~15％％ ）。

   2））缓冲液离子组成的不连续性主要是阴离子不同缓冲液离子组成的不连续性主要是阴离子不同（（Gly-, Cl-）   3））凝胶的凝胶的pH不同电极缓冲液为不同电极缓冲液为pH8.3的的Tris-甘氨酸甘氨酸缓冲液，浓缩胶为缓冲液，浓缩胶为pH6.8的的Tris-HCl缓冲液，而分离胶缓冲液，而分离胶为为pH8.9 的的Tris-HCl缓冲液  4））在电场中形成不连续的电位梯度在电场中形成不连续的电位梯度     在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高Tris-Gly  pH=8.3Tris-Gly  pH=8.3Tris-HCl  pH=6.8T=3%Tris-HCl  pH=8.9T=7.5%4. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳•聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。

这种差异就蛋白质分子本身而言，泳迁移率的不同这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关•当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（（SDS））时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量 SDS的作用原理的作用原理 •这种阴离子去污剂能够与蛋白质结合，破坏蛋白质这种阴离子去污剂能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象使蛋白质变性而改变原有的空间构象 •当当SDS的总量为蛋白量的的总量为蛋白量的3～～10倍且倍且SDS单位浓度大单位浓度大于于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合白质可结合1.4克克SDS •蛋白质分子一经结合了一定量的蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。

且由于分子量不同种类蛋白质间电荷符号的差异且由于分子量越大的蛋白质结合的越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质这就使各蛋白质-SDS复合物的复合物的电荷密度趋于一致电荷密度趋于一致•不同蛋白质的不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长复合物形状也相似，均是长椭球状椭球状 •在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的复合物的大小，也可以说是大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小取决于蛋白质分子量的大小，而与，而与蛋白质原来所带电荷量无关蛋白质原来所带电荷量无关•  m = V/E = Q/6πrη   令：     Q/η = C 则： m = V/E = C/6πr在在SDS-电泳中，蛋白质的泳动度与其大小成反比电泳中，蛋白质的泳动度与其大小成反比测定蛋白质分子量•当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在17,000～～165,000之间时，之间时，蛋白质蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：量的对数呈线性关系：lgMW=lgK－－bm •MW为蛋白质的分子量，为蛋白质的分子量，m为相对迁移率，为相对迁移率，K为常数，为常数，b为斜率为斜率 •将将已已知知分分子子量量的的标标准准蛋蛋白白质质在在SDS SDS - -聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的电电泳泳迁迁移移率率对对分分子子量量的的对对数数作作图图，，即即可可得得到到一一条条标标准准曲曲线线。

只只要要测测得得未未知知分分子子量量的的蛋蛋白白质质在在相相同同条条件件下下的的电电泳泳迁迁移移率率，，就就能能根根据标准曲线求得其分子量据标准曲线求得其分子量5.聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳( (IsoelectricIsoelectric Focusing-PAGE Focusing-PAGE，，IEF-PAGE)IEF-PAGE)•聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中加加入入一一种种合合成成的的两两性性电电解解质质载载体体，，在在电电场场的的作作用用下下会会自自发发形形成成一一个个连连续续的的pH梯梯度度蛋蛋白白质质样样品品在在电电泳泳中中被被分分离离，，运运动动到到等等电电点点胶胶层层时时就就失失去去所所带带电电荷荷而而稳稳定定停停留留在在该该处处，，样样品品中中不不同同蛋蛋白白质质组组分分等等电电点点不不同同，，因因而而在在等等电电聚聚焦焦电电泳泳中中得得到到有有效效分分离离在在等等电电聚聚焦焦电电泳泳中中，，利利用用各各蛋蛋白白质质组组分分等等电电点点的的差差异异，，并并不不利利用用凝凝胶胶的的分分子子筛筛作作用用它它的的分分辨辨力力高高，，可可分离等电点相差分离等电点相差0.01~0.02pH单位的蛋白质。

单位的蛋白质载体两性电解质商品有载体两性电解质商品有ampholine(LKBampholine(LKB公司公司) )、、Pharmlyte(Pharmacia)Pharmlyte(Pharmacia)、、Serralyte(ServaSerralyte(Serva) )以及国产以及国产的的AmpholineAmpholine( (上海生化所东风厂生产上海生化所东风厂生产) )AmpholineAmpholine是是具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物CH2=CHCOOHCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NHRNHR(                       )nCH2-CH2NHCH2-CH2NHCH2-CH2NRNHR(                       )nCH2CH2COOHCH2CH2COOH随机加成随机加成多胺同系物多胺同系物丙烯酸丙烯酸加成度不同的混加成度不同的混合物，分子量大合物，分子量大小不同，胺基和小不同，胺基和羧基的比例不同羧基的比例不同载体两性电解质及对应的电极缓冲液载体两性电解质pH阳极电极液阴极电极液LKB    3.5—9.5    5.8—8.5    4.0—6.54.0—5.02.5—6.07.5—10.5 1 mol·L-1磷酸0.4mol·L-1 HEPES*或1%Ampholine含0.1mol·L-1谷氨酸的0.5mol/L磷酸溶液1mol·L-1磷酸1mol·L-1磷酸1mol·L-1NaOH 1 mol·L-1NaOH0.1 mol·L-1NaOHo.1 mol·L-1β-丙氨酸1 mol·L-1甘氨酸0.5%Ampholine0.1%AmpholinePharonacia3.0—102.5—5.04.0—6.55.0—8.06.5—9.08.0—10.5 4.0n mol·L-1天冬氨酸0.1mol·L-1H2SO440m mol·L-1谷氨酸40m mol·L-1谷氨酸0.25mol·L-1 HEPES0.25mol·L-1 HEPES 1 mol·L-1 NaOH0.1 mol·L-1 NaOH或0.2mol/L 组氨酸0.2 mol·L-1L 组氨酸1 mol·L-1 NaOH1 mol·L-1 NaOH1 mol·L-1NaOH•主要理化性质为：主要理化性质为：•①①缓缓冲冲性性能能强强 AmpholineAmpholine溶溶液液在在一一定定PHPH范范围围内内有有充充分分的的缓缓冲冲能能力力，，当当蛋蛋白白质质进进入入与与其其等等电电点点相相应应的的PHPH区区域域时时，，PHPH值并无变化；值并无变化；•②②导导电电性性能能好好 AmpholineAmpholine溶溶液液有有均均衡衡的的电电场场强强度度，，但但是是在在PHPH等等于于中中性性的的区区域域导导电电性性能能较较差差。

因因此此在在应应用用时时，，不不管管选选择择什什么么PHPH范范围围，，一一般般都都要要加加入入其其总总量量1/101/10的的PH6PH6～～8 8的的AmpholineAmpholine溶液，以保持电场强度的均匀性；溶液，以保持电场强度的均匀性；•③③分分子子量量小小 AmpholineAmpholine一一般般分分子子量量都都在在300300～～10001000之之间间一一便便用用分分子子筛筛或或透透析析等等方方法法将将它它与与被被分分离离的的高高分分子子物物质质分分开；开；•④④紫紫外外吸吸收收值值低低 AmpholineAmpholine对对于于在在280280nmnm处处测测定定蛋蛋白白质质吸吸收收值值的的干干扰扰小小，，但但是是如如果果蛋蛋白白质质浓浓度度低低，，AmpholineAmpholine用用量量又高，则往往干扰较明显，严重时应进行矫正；又高，则往往干扰较明显，严重时应进行矫正；•⑤⑤一般与样品不起化学反应一般与样品不起化学反应pH梯度形成的机制梯度形成的机制•载体两性电解质既有酸性基团载体两性电解质既有酸性基团( (—NHNH2 2＋＋－－) )，，也有碱性基团也有碱性基团( (—COOCOO－－) )，，既可接受分子，也可释放质子。

既可接受分子，也可释放质子•在溶液中的两性电解质一方面受溶液在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变值有所改变•在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中电泳时凝胶板正极的电极在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中电泳时凝胶板正极的电极液是磷酸，负极是氢氧化钠液是磷酸，负极是氢氧化钠 ◆◆◆◆正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI的的不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时，向负极泳动的速度也就不同，其所带正电荷数量就有所差异电泳时，向负极泳动的速度也就因此不同因此不同 ◆◆◆◆ 负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动以不同速度向正极泳动 ◆◆◆◆在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。

当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点当达到平衡时，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的并各处于自己的pI区域，区域，不在移动不在移动 ◆◆◆◆ 所以，溶液也因此呈现不同的所以，溶液也因此呈现不同的pH，，随载体两性电解质的随载体两性电解质的pI梯度而形成梯度而形成pH梯度 +-pH 3pH 10pH 7NaOHH3PO4+++++-----6. 双向电泳双向电泳（（two-dimensional electrophoresis））•如果将等电聚焦电泳与如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳就是分辨率更高的一种双向电泳•双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别所以双向电向反映出它们在分子量上的差别所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。

及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开•单向单向单向单向SDSSDSSDSSDS－－－－PAGEPAGEPAGEPAGE电泳分辨力差，仅能分开电泳分辨力差，仅能分开电泳分辨力差，仅能分开电泳分辨力差，仅能分开50505050左左左左右种的蛋白；右种的蛋白；右种的蛋白；右种的蛋白；IEF-PAGEIEF-PAGEIEF-PAGEIEF-PAGE分辨力稍高，也只能分分辨力稍高，也只能分分辨力稍高，也只能分分辨力稍高，也只能分开开开开100100100100多种蛋白质；双向电泳可分辨多种蛋白质；双向电泳可分辨多种蛋白质；双向电泳可分辨多种蛋白质；双向电泳可分辨1000100010001000种以种以种以种以上的蛋白质，一般为上的蛋白质，一般为上的蛋白质，一般为上的蛋白质，一般为2000200020002000～～～～15000150001500015000种（四）毛细管电泳（四）毛细管电泳1.定义：   毛细管电泳是在散热效率极高的、空芯的、微小内径（10-200μm）的毛细管内进行的大、小分子高效分离技术2. 毛细管电泳仪基本结构图毛细管电泳仪基本结构图毛细管：长：47cm, 57cm, 67cm;直径：5-200 μm进样系统：气压进样、电压进样。

冷却系统:液冷、风冷高压系统:1-30kV毛细管电泳的检测器：紫外检测器、二极管阵列检测器、激光诱发荧光检测器、电化学检测器、质量（质谱）检测器等PRINCE 700毛细管电泳仪毛细管电泳仪CEC-加压毛细管电色谱加压毛细管电色谱3. 毛细管电泳的分类毛细管电泳的分类1、毛细管区带电泳（、毛细管区带电泳（CZE））2、、分子体积排除（筛滤）电泳或分子体积排除（筛滤）电泳或      凝胶电泳（凝胶电泳（CGE））3、、等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IEF））4、、胶束电动力学电泳（胶束电动力学电泳（MECC））5、、等速聚焦电泳（等速聚焦电泳（ITP））4. 毛细管电泳的主要优点毛细管电泳的主要优点1、高灵敏度、高灵敏度2、高分辨、高分辨3、速度快、速度快4、进样少、进样少5、成本低、成本低高灵敏度：紫外检测器的检高灵敏度：紫外检测器的检测极限在测极限在10-13—10-15mol之之间，荧光检测可达间，荧光检测可达10-19—10-21mol高分辨：峰分离效率超过高分辨：峰分离效率超过1百万理论百万理论塔板数，一般可达几十万塔板数，一般可达几十万速度快：许多分析在速度快：许多分析在10分分钟内完成。

钟内完成进样少：一般需要毫微升的进样量成本低：一般只需要可长期使用的毛细管和极微量的可自己配制的缓冲液5.毛细管电泳的应用领域            小型离子小型离子              小分子小分子             肽类肽类             蛋白质蛋白质              低聚核苷酸低聚核苷酸                DNA毛细管电泳的应用选择毛细管电泳的应用选择小型离子   小分子   肽类     蛋白质   低聚核苷酸  DNA    CZE        MECC    CZE       CZE          CGE         CGE    ITP          CZE       MECC   CGE          MECC                        ITP         IEF         IEF                                   CGE       ITP                                   ITP。