第三章抗体123v上课讲义.ppt

第三章 抗体（Ab） 内 容一、基本概念二、免疫球蛋白的分子结构三、免疫球蛋白的特点与功能四、抗体的生物学活性五、免疫球蛋白的免疫原性六、人工制备的抗体 抗体（antibody,Ab) ： 机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白 主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig) 一、基本概念单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式*4 抗体和免疫球蛋白的关系: 抗体都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性 分泌型Ig(sIg)和膜型Ig(mIg)二、免疫球蛋白的分子结构二、免疫球蛋白的分子结构（一）免疫球蛋白的基本结构（一）免疫球蛋白的基本结构 四肽链结构 ，链间二硫键连接;两条重链（H）和两条轻链（L）;氨基端和羧基端 (1)根据重链分类： 根据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列顺序不同，将重链分为五种：、 根据重链组成不同，将Ig分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)根据轻链分型： 、型 各类Ig都有、两型轻链分子。

1.重链与轻链根据氨基酸排列顺序的不同分为：可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变 化较大恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序及 含糖量都比较稳定铰链区(hinge region)：位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解 2.可变区与恒定区超变区（ HVR）轻链：24-34、50-56、89-97重链：31-35、50-65、95-102框架区（FR）超变区决定簇互补区（CDR） Ig的抗原结合部位， 该部位也称为CDRIg的独特型决定簇 位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解3. 铰链区4. J链和分泌片 J链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆细胞合成，以二硫键的形式共价结合到Ig的重链上 分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式结合到二聚体上，保护IgA，使之不受环境中酶的破坏，并介导IgA的转运二）免疫球蛋白的水解片段（二）免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶(papain)水解IgG：得到两个相同的Fab段和一个Fc段二）免疫球蛋白的水解片段（二）免疫球蛋白的水解片段胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一个具有双价活性的F（ab）2段和若干个小分子多肽碎片（pFc）。

三）免疫球蛋白的功能区 Ig的H链、L链每隔110个氨基酸即由链内二硫键连接形成一个能行使特定功能的球性单位，称为Ig的结构域或功能区（domain）VH和VL:识别和结合抗原；CH和CL:同种异型的遗传 标志CH2:补体C1q结合位点， IgG 可通过胎盘CH3/CH4:与多种细胞表面的FcR结合(免疫调理,I型超敏反应)各功能区的作用IgG多为单体，是唯一能通过胎盘的抗体，据重链（链）免疫原性，IgG分4个亚型一）IgG三、五类免疫球蛋白的特性与功能 IgG1、IgG2和IgG3能通过经典途径激活补体；（补体是存在于人或脊椎动物血清与组织液和细胞膜表面的一组被激活后具有酶活性的蛋白质,包含30多种成分,被称为补体系统 血清含量最高75%85 %， 是介导体液免疫的主要抗体；半衰期较长：1624d； 主要的作用：溶解靶细胞 、促进吞噬、中 和、溶解病毒 、炎症介质作用；参与II、 III型超敏反应IgG的特点 为五聚体，是分子量最大的Ig，称巨球蛋白 IgM激活补体、结合抗原、免疫调理作用比IgG强 天然血型抗体是IgM二）IgM IgM是个体发育中最早产生的抗体，胚胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若IgM水平升高，提示胎儿曾有宫内感染。

IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断mIgM是B细胞抗原受体（BCR）的主要成分,也可参与II、III型超敏反应IgM的特点 mIgM是B细胞抗原受体（BCR）的主要成分,也可参与II、III型超敏反应(一型過敏反應：立即性過敏反應(immediate hypersensitivity reaction) 機制：體內原先曾接觸過敏原，且已經對過敏原產生特異性抗體 (IgE)當再次接觸過敏原時，體內肥大細胞 (mast cells)或嗜碱性粒細胞 (Basophils)立即釋放組織胺(histamine), leukotrienes等引起過敏症狀的物質二型過敏反應：細胞毒性（cytotoxic）機制：体内內原先曾接觸過敏原，且已經對過敏原產生特異性抗體( IgG或IgM)具特異性的IgG或IgM抗體與細胞表面的過敏原結合，藉由活化補體或细胞毒性T細胞，破壞被過敏原所附著的細胞三型過敏反應：透過免疫複合物活化補體 (immune complex) 機制：過敏原與體內的IgG或IgM形成免疫複合物，堆積在體內，引起补体被活化，造成组织的破壞四型過敏反應：遲發型，細胞媒介 (cell-mediated) 機制：過敏原引起體內CD4+T細胞被活化，因而釋出細胞間素（cytokine）導致組織和器官受損，常於暴露過敏原24-72小時後發生。

) 分为血清型和分泌型两种血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生，占免疫球蛋白的10%-15%,为单体而分泌型IgA（sIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生，为双体sIgA主要存在于唾液、泪液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中三)IgAIgA的特点参与皮肤粘膜的局部抗感染作用；初乳中含有高浓度的sIgA-母乳喂养；通过替代途径激活补体；参与型超敏反应sIgA的合成和主要作用部位在黏膜很少分泌，在血清中含量极低，占血清总Ig的0.2%，在血清中含量为30ug/ml,不稳定，易降解， IgD是B细胞的重要表面标志，mIgD的出现标志着B细胞成熟，对防止免疫耐受有一定作用四)IgD血清中含量很低，在血清中含量为0.3ug/ml,是一类亲细胞抗体，可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fc 受体FcR）（ 、 ）结合，引起型超敏反应，Fc R分布于巨噬细胞、B细胞、嗜酸粒细胞五)IgE四、免疫球蛋白的生物学活性 V区的功能: Fab片段的生物学活性 抗体 结合抗原的活性由Fab所呈现，由VH和 VL所组成的抗原结合部位，可结合抗 原，是决定抗体分子特异性的部位。

C区的功能： Fc片段的生物学活性：该片段无结合抗原活性，但与抗体分子的生物学活性有密切关系：1、选择性地通过胎盘；2、与补体结合活化补体；3、决定Ig分子的亲细胞性(即与带Fc受体细胞的结合)；4、Ig通过粘膜进入外分泌液等都是Fc片段的功能 补体结合位点位于CH2上；Fc受体结合位点在CH3上 五、免疫球蛋白的免疫原性Ig是蛋白质，因此一种动物的Ig对另一种动物而言是良好的抗原Ig抗原特异性：Fc片段是Ig分子中的重链恒定区，因此它是决定各类Ig抗原特异性的部位用Ig免疫异种动物产生的抗抗体(第二抗体)，可与相应Ig发生抗原抗体反应 免疫球蛋白的不同结构区其免疫原性不同：同种型（isotype）：指在同一种动物所有个体的不同类型的Ig共同具有的抗原特异性，同种间不表现出抗原性，只是在异种动物之间才表现出抗原性 Ig的同种型抗原决定簇主要存在于重链C区 同种异型（allotype）：指Ig在同一种动物不同个体之间呈现出的抗原性同种异型的抗原决定簇存在于IgG、IgA、IgE的重链C区和k型轻链的C区同种异型是Ig稳定的遗传标志，可用于亲子鉴定 独特型（idiotope）：抗体分子的特异性是由Ig的重链和轻链可变区所决定的，因此体内针对不同抗原分子的抗体之间的差别表现在Ig分子的可变区，这种差别就决定了抗体分子在机体内具有抗原性，由抗体分子的可变区呈现的抗原性就称为Ig的独特型。

独特位：独特型由Ig可变区若干个抗原决定簇所组成，它们被称为独特位独特型在异种、同种异体乃至同一个体内均可刺激产生相应的抗体，称为抗独特型抗体同种型(isotype):同一物种内所有个体共同具有的Ig抗原特异性结构同种型Ig的抗原决定簇存在于CH、CL据CH的不同，Ig分类、亚类据CL的不同，Ig分型、亚型同种异型（allotype)：同一物种内不同个体间的Ig免疫原性的差别独特型（idotype)：同一个体内不同B细胞克隆产生的Ig其超变区各自具备独特的抗原决定簇结构1、多克隆抗体：多个抗原决定基机体多种抗体的混合物2、单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）：由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的、针对某一特定抗原决定簇的高度特异性抗体3、基因工程抗体：利用基因工程技术来制备的抗体分子称为基因工程抗体，是分子水平的抗体六、人工制备的抗体1、多克隆抗体(PcAb) 采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同途径进入动物体内，经免疫后，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体细菌病毒抗原，均是由多种抗原成分组成，即使纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位，因此进入机体后可激活许多淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原成分或抗原表位的抗体，由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性。

一只小鼠能产生约107-108 种不同抗体，人约109种2、 单克隆抗体(McAb) 由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体 McAb的特点： McAb的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同 McAb技术原理：用人工的方法将产生特异性抗体的B细胞与同系骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤所产生的抗体即为单克隆抗体二）B细胞杂交瘤株建立与McAb生产技术 基本过程：B细胞的制备、骨髓瘤细胞的制备-细胞融合-检测抗体-杂交瘤细胞的克隆化-细胞株冻存或单克隆抗体的生产 单克隆抗体的问世，极大地推动了免疫学及其他生物科学的发展，并于1984年获得诺贝尔奖 McAb优点 与多克隆抗体比较， McAb具有无可比拟的优越性，具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低、并可大量生产等优点 (1) B细胞的制备：可用提纯的抗原免疫Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次间隔2-4周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾脏，制成103/ml的脾细胞悬液，即为亲本的B细胞。

(2) 骨髓瘤细胞的制备：用与免疫相同品系小鼠的骨髓瘤细胞，要求其本身不能分泌Ig，而且具有某种营养缺陷，可用SP2/0或NS-1，它们缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，不能在HAT培养基上生长 (3) 饲养细胞的准备：常用小鼠巨噬细胞或胸腺细胞作为饲养细胞 (4) 选择培养基：常用HAT选择培养基，H为次黄嘌呤，T为胸腺嘧啶核苷，二者都是旁路合成DNA的原料；A是氨基喋呤，是细胞内源性合成DNA的阻断剂在该培养基中，末融合的骨髓瘤细胞不能生长，因它不能利用旁路途径合成DNA，内源性的合成又受到氨基喋吟的阻断；至于未融合的脾细胞则在2周内自然死亡，所以只有融合的杂交瘤细胞才能在该培养基中生长 (5) 细胞融合 将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例(一般3:1-5:1)混合，离心后弃上清液，然后缓慢加入融合剂50聚乙二醇(PEG4000)，摇动试管静置90s，逐渐加入HAT培养基，分于加有饲养细胞的96孔培养板孔中，置5-10CO2培养箱中培养5d后更换一半HAT培养基，再5d后改用HT培养基，再经5d后用完全DMEM培养基 (6) 检测抗体 杂交瘤细胞培养后，应用敏感的血清学方法检测各孔中的抗体。