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靶标代谢组学技术在不同代谢物群研究中的应用 　　继基因组学、转录组学和蛋白质组学等各种"组学";之后，代谢组学已迅速发展成为系统生物学的一个重要分支代谢组学是考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后） 其所有小分子代谢产物的变化或其随时间的变化，用以研究生物体系代谢途径的一种技术[1].区别于其他组学针对生物大分子水平的研究，代谢组学关注的核心是小分子代谢产物群的变化，进而从小分子代谢物变化的整体水平来揭示生命过程的动态变化和调控规律根据研究对象和目的的不同，代谢组学的研究模式主要分为两种[2-3]:非靶标代谢组学和靶标代谢组学 　　非靶标代谢组学[2,4-5]研究较为普遍，旨在尽可能全面地分析生物样本中所有代谢物（包括未知化合物），从总体上把握整体轮廓及其代谢变化规律，寻找潜在生物标志物，具有全局分析的优势但同时也存在一定的不足，如易遗漏一些低浓度物质的变化，达不到全局分析的目的；进行半定量分析，准确度不高，结果可信度较低；只是一个相对模糊的全景模式，对于不同的疾病和代谢路径缺乏特异性非靶标代谢组学分析较多地采用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR） 和气相色谱串联质谱（gas chromatography-mass spectroscopy,GC-MS）技术平台。

　　NMR能实现对样品的非破坏性、非选择性分析，满足对尽可能多的化合物进行检测的目标；GC-MS具有较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考的标准谱图数据库，可以用于代谢物的准确定性分析随着新的分析方法的不断发展，目前对于非靶标代谢组学的分析，往往通过组合不同的分析技术，以实现代谢组的全面分析　　靶标代谢组学[2,4]是对特定的目标代谢物的精确定性定量分析，主要研究特定结构功能类型的代谢物群，例如脂肪酸类、磷脂类、嘌呤嘧啶类或氨基酸类等作为一种特定模式，可以根据非靶标代谢组学的研究结果，对特定的代谢物群进行定量分析，弥补非靶标代谢组学的不足其主要优势是可以利用建立的数据库，结合多种代谢通路，对目标代谢物进行定量分析，准确度高，特异性强但其缺点[6]是需依赖先验知识，建立方法依赖于标准品，对于生物样本代谢组信息的覆盖仍有局限，不适用于大规模的代谢轮廓分析靶标代谢组学分析主要采用基于质谱的分析技术，三重串联四级杆质谱[7]（triple quadrupole/mass spectroscopy,Q/MS）因其在定量分析上的独特优势成为靶标代谢组学分析的首选气相色谱三重串联四级杆质谱（GC-Q/MS）和液相色谱三重串联四级杆质谱（LC-Q/MS）联用技术可以对不同极性的目标代谢物进行高选择性﹑高灵敏度和高通量的定量分析，完成对大量生物样本潜在生物标志物的验证。

一般在 GC-MS系统上用选择离子监测 （selected ion monitoring,SIM）或者在 LC-MS 系统上用多反应离子监测（mul-tiple reaction monitoring,MRM）进行靶向 MS/MS 分析[3],其中 LC-MS 因其样品处理过程简单、分析速度快等优势，应用更为广泛本文主要介绍靶标代谢组学技术在不同代谢物群研究中的应用　　1 脂类化合物　　脂类是一类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生物有机分子对于大多数脂类而言，其化学本质是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物由于脂类结构复杂，功能繁多，生物样本本身又相当复杂，因此迄今没有一种分析手段能独立完成系统的大规模脂类分析常用的脂类物质分析技术有软电离质谱 和 液 质 联 用 , 如 电 喷 雾 电 离（electrosprayionization）质谱（ESI/MS）技术在脂类的表征、定性和定量分析中就发挥了重要的作用随着研究不断深入，新的分析方法不断建立，脂类代谢物数据库不断发展完善　　脂肪酸是构成人体脂肪和类脂的基本物质，是细胞膜磷脂的重要成分[8].研究表明[9-14],脂肪酸代谢紊乱与某些疾病的发生有着密切的联系，检测脂肪酸代谢的动态变化可用于研究机体从稳态发展为疾病的过程，或者机体在接受治疗后由疾病恢复到稳态的过程。

此外，脂肪酸含量变化也可作为某类疾病的生物标志物，用于疾病的预警和诊断脂肪酸是由一条长的烃链和一个末端羧基组成的羧酸，烃链的长度和不饱和度很大程度上影响了脂肪酸的性质脂肪酸的分析常采用 GC-MS 技术，但是该法提取和衍生化过程繁琐；而 LC-MS 分析方法因样品处理过程简单而得到越来越多的应用　　近年来，短链脂肪酸（short chain fatty acids,SCFA）和支链氨基酸（branched chain amino acids,BCAA）因其在生理和病理过程中的重要作用，而受到研究者的广泛关注Zheng 等[15]采用氯甲酸丙酯（propyl chloroformate,PCF）衍生化的方法，用 GC-MS 同时测定喂食不同营养成分的家兔粪便样品中SCFA 和 BCAA 的含量在 pH 8 的水∶丙醇∶吡啶（V/V/V=8∶3∶2）反应液中加入 100 μl PCF 进行衍生，然后用正己烷对衍生后的产物进行两步提取该法衍生化效率高、检测限低、回收率高，已成功用于正常人粪便、血浆及尿样中 SCFA 和 BCAA 的检测　　类二十烷酸也称类花生酸，由二十碳多不饱和脂肪酸衍生而来，大多数的类二十烷酸是花生四烯酸的衍生物，如前列腺素类（prostaglandin,PG），凝血 唑恶 烷 类 （thromboxanes,TX） 和 白 三 烯 类（leukotriene,LT）。

类二十烷酸是炎症和氧化应激反应中的主要调节介质，也常作为某些病理状态或癌症的生物标志物不同类型的二十烷酸化学性质可能不同，加上其相对不稳定性，使得类二十烷酸的全面定量分析变得困难尿液中类二十烷酸的分析通常采用 GC-MS 或 LC-MS/MS,但一般需要复杂的样品提取和衍生化过程对于类二十烷酸的分析方法已有大量研究报道，但对于不同代谢通路产生的类二十烷酸的定量分析研究比较罕见Sterz 等[16]使用超高效液相色谱-串联质谱 （ultra performanceliquid chromatography-SIM-MS/MS,UPLC-SRM-MS/MS）建立了一种简单灵敏的方法用于定量分析尿液中的类二十烷酸相比于耗时复杂的固相提取方法，该研究采用了一种较为简单的液液提取方法；此外，所有化合物进入质谱后，在选择反应监测（selected reaction monitoring,SRM）模式下，经碰撞解离产生特征离子对，不需要进行衍生化，即可进行检测，操作简便采用该法实现了对尿液中多种主要类二十烷酸的定量分析，包括 PG 类（PGE-M、PGF2a）、TX 类（TXB2）、LT 类（LTE4）及 12-羟基花生四烯酸等。

该方法成功应用于吸烟者尿液中类二十烷酸的测定（吸烟和尼古丁的摄入会引起尿液中类二十烷酸水平的升高），证明了该法的适用性　　二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）在大脑中含量非常丰富，是一种对人体非常重要的ω-3 多不饱和脂肪酸，对维持大脑的正常功能具有重要作用研究表明，DHA 含量变化和氧化作用的发生与神经退行性疾病相关；在某些病理状态下，DHA 的氢过氧化物（hydroperoxy-DHA,HpDoHE）和氢氧化物（hydroxide-DHA,HDoHE）的含量也会有所增加可见对于 DHA 氢过氧化物和氢氧化物的鉴定和分析具有重要的临床意义Derogis 等[17]建立了一种灵敏度高、专属性强的方法，用于定量分析 12 种主要 HpDoHE 和氢 HDoHE 的异构体在该研究中，通过光致氧化合成 HpDoHE,然后进一步使用硼氢化钠（NaBH4）还原得到 HDoHE.分离得到的异构体使用 LC-MS/MS 的 SRM 模式为每一个异构体创建相应的特征离子对，实现了对各个异构体的定量分析采用该法测定大鼠血浆和脑中 HpDoHE及 HDoHE 异构体的含量，已证明其适用性。

此外，该法可用于 HpDoHE 和 HpDoHE 衍生物的鉴定和定量分析，对于氧化脂质组的研究也具有重要的意义　　磷脂是生物组织中非常重要的一类脂质，不仅是生物膜的主要成分，并且作为重要的代谢物参与大量的生命活动（如细胞中信号转导、膜固定及底物转运等）正是由于在生物体代谢过程中的重要作用，磷脂也成为脂质组学研究的一个热点质谱被广泛应用于磷脂的分析，但由于离子抑制效应等因素，低丰度的磷脂往往较难检测出来在进行质谱分析前，对不同种类的磷脂进行预分离，可提高检测的灵敏度和重复性Kim 等[18]采用 HPLC-MS 从大鼠心脏和骨骼肌线粒体中分离检测到 7 种磷脂类化合物（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、心磷脂及单溶心磷脂），并且对其中 6 种（磷脂酰丝氨酸除外）进行了定量分析该法优化了提取纯化步骤，提高了灵敏度和重复性，为线粒体中磷脂类化合物的分析提供了一种较好的定性和定量分析方法　　鞘磷脂即鞘氨醇磷脂，在磷脂酶的作用下，可水解为磷酰胆碱和神经酰胺，这些代谢物在调节细胞生长、分化和程序性死亡的机制中发挥着重要的作用Blaas 等[19]以 C6-鞘磷脂为内标，采用亲水作用色谱-高效液相串联质谱（HILIC-HPLC-ESI-MS/MS）对人体母乳中的鞘磷脂进行了定量分析；提取后的母乳样品采用硅胶固相提取方法纯化，分离得到的鞘磷脂经磷脂酶水解得到相应的神经酰胺，然后采用反相高相液相串联质谱（RP-HPLC-ESI-MRM/MS/MS）对鞘磷脂进行了结构确证。

该法为母乳中不同结构类型的鞘脂的研究提供了新的思路　　2 肉毒碱　　肉毒碱是类维生素，是机体脂肪酸代谢必需的一种辅酶，可与长链脂肪酸结合形成酰基肉碱，作为载体，将脂肪酸运送至线粒体基质中，完成 β-氧化；此外，在支链氨基酸的代谢中肉毒碱也发挥着重要的作用血浆中肉毒碱和酰基肉毒碱的检测，对于诊断由脂肪酸代谢紊乱引起的疾病具有很大的帮助　　Peng 等[20]采用串联四级杆离子阱质谱（QTRAP-MRM-MS/MS）建立了一种快速准确的方法来分析肉毒碱和酰基肉碱该法无需衍生化，避免了以往文献中存在的衍生化反应不完全及酰基肉碱水解等影响因素；采用 HILIC 预先分离肉毒碱和酰基肉碱，可以较好地分开各异构体，排除干扰物质的影响，避免假阳性结果为考察方法的适用性，对 216名健康人和 116 名患者血浆中肉毒碱和酰基肉碱进行检测，结果发现 49 名患者为有机酸血症或者脂肪酸代谢紊乱　　对乙酰氨基酚（paracetamol）是一种广泛使用的止痛剂，过量服用会造成肝毒性或引起其他急性肝损伤线粒体功能障碍和氧化应激损伤是对乙酰氨基酚导致肝损伤的重要作用机制新研究发现，服用过量对乙酰氨基酚患者的血浆中谷氨酸脱氢酶活性增强，线粒体 DNA 的浓度增加，并将其作为线粒体损伤的生物标志物。

但是这些标志物相对分子质量较大，要在细胞死亡或细胞膜破损时才能从细胞中释放出来McGill 等[21]采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS），应用代谢组学的方法来筛选线粒体损伤的生物标志物呋塞米（呋喃苯胺酸，furosemide）是一种利尿剂，也可以引起肝损伤，但给药初期不会造成线粒体损伤，对小鼠分别给予过量对乙酰氨基酚和呋塞米，发现给予对乙酰氨基酚的小鼠血浆中 3 种酰基肉碱的含量增加，而给予呋塞米的小鼠血浆中未发现酰基肉碱含量的显着变化，表明酰基肉碱的含量变化也许可以作为小鼠线粒体功能障碍的特征生物标志物采用该方法，检测服用过量对乙酰氨基酚而致肝损伤的患者血浆中的酰基肉碱含量，结果未发现酰基肉碱的显着变化分析其可能的原因。