超量共表达NSAKT1和ATDWF4烟草抗渗透胁迫能力研究.docx

    超量共表达NSAKT1和ATDWF4烟草抗渗透胁迫能力研究    韦春 秦利军Summary：为了解钾和油菜素内酯（BRs）在调控植物抗逆境胁迫中的作用，以超量表达K吸收基因NSAKT及BRs合成基因AIDF4的转基因烟草为材料，分析PEG渗透胁迫对其形态及抗性指标等的影响结果表明，PEG胁迫3d时，转基因烟草SOD活性即达到极值且显著高于非转基因烟草（Wt），其中以共转AKTI/DWE4植株中SOD活性最高;而PG胁迫1d时，3种转基因植株的POD活性均显著（《005）高于Wt植株，且共转AKTIDWF4植株中POD活性分别是单转AKT植株的1.28倍、单转DF4植株的1.40倍和W植株的1.90倍PEG胁迫第3天时，共转AKTDF4植株中CAT活性增幅最大，达59.18%，显著高于其他2种转基因烟草同时，H2O2和MDA含量定表明，PEG处理后Wt中MDA和HO2含量均在第5天时达极值，分别为58.52nong和38.21gg，均显著高于转基因烟草另外，特征基因表达分析表明，NsAK和ATDWFE4可能协同调控共转1KTI/DWF4烟株对PEG渗透胁迫的抗性本研究为进一步揭示K和BRs协同介导的烟草抗逆境胁迫应答机制以及创制优良的烟草新种质奠定理论依据。

Key：烟草;AKT：DF4;抗旱性钾不仅能维持植物细胞内稳态平衡和控制气孔开闭，还能改善烟草制品的安全性环境中K主要是通过质膜上的K通道（potassium channel，PC）进入植物体内4PC根据结构和功能不同，又可分为Shaker家族通道、KCO家族通道和其他通道钾转运蛋白1（Arabidopsis-ike e potassium transporter，AKT）是Shaker家族中的K钾离子通道，能在低K环境（10 umol/L）中促进植物吸收K79在水稻（Oryza sativa）中，OSAKTI既能调节水稻在盐胁迫下对K的吸收，又能提高水稻对干旱胁迫的抗性近年来，植物激素（plant hormones）介导的非生物胁迫抗性也被广泛报道其中，油菜素内酯（brassinosteroids，BRs）作为一种重要的甾醇类激素，参与了细胞分化、维管束发育及植物抗逆等过程1芸苔素内酯（brassinolide，BL）作为BRs的活性形式，其生物合成已被证明至少需要经由3条途径，而DF4是催化这3条途径的关键限速酶718在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，该酶与拟南芥类固醇羟化酶（Constitutive photomorphogenesis and dwarfism，CPD）具有43%的同源性。

研究发现，超量表达DIF4不仅能增加油菜（Brassica napus）种子产量和对小球腔菌（Leptosphaeria maculans）和菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性，还能有效改善拟南芥和番茄（Solanum lycopersicum）的营养生理状态尽管OSAKT1和DF4两者单独调控植物发育及抗性较多，但鲜有对两者协同介导的非生物胁迫应答进行报道，本试验立足于提高烟叶中钾素含量和改善烟叶品质，研究两者间协同促进转基因植株对渗透胁迫的抗性，以期为培育钾含量高、抗旱能力强的烟草新种质提供理论依据1材料与方法1.1材料普通烟草（Nicotiana tabacum）品种K326，植物表达载体pRI201-35SAKTI、pRI201-rdDw4和pRI201-35SAKTI/rddwfa4均由贵州大学农业生物工程研究院保存、构建并提供植物激素及抗生素购于Sigma-Aldrich公司;植物表达载体pRI201-AN购于Takara公司;普通质粒小提试剂盒及新型植物DNA提取试剂盒均购于TIANGEN BIOTECH公司;Multiscribe M Reverse Transcriptase Kit n POWERSYBRGreen PCR Master MixKit均购自Applied Biosystems公司物对F-35Sakt/R-Akthsp和F-IddwfR-Dwfhsp及Real-timePCR分析相关引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法1.2.1载体构建以购自Takara公司的植物表达载体pRI201-AN（Code No.3264）为起始载体，利用Ne和SalI对其进行双酶切，同时以这2个酶双酶切人工合成的、两端含有NeI和SalI酶切位点的NSAKTI基因序列分别胶回收上述两种酶切产物，酶切产物依次经T4DNA连接酶连接和酶切验证后，构建植物表达载体pRI201-35 Saktl（图1A）利用KpI和Nor对植物表达载体pRI201-35Aktl进行双酶切：利用KpI和NorI对植物表达载体pRI20-AN（Code No.3264）进行双酶切，同时以这2个酶双酶切人工合成的、两端含有KpnI和NorI酶切位点的ATDWF4基因表达元件ADF4基因表达元件由A.thaliana rd29A基因启动子、A.thaliana DWF4基因及A.Thaliana HSP基因终止序列3部分组成分别胶回收上述两种酶切产物，酶切产物依次经T4DNA连接酶连接和酶切验证后，构建植物表达体pRI201-rddwf（图1B）以构建的pRI201-35 SAKTI为中间载体，利用KmI和NoI将ADWF4基因表达元件从植物表达载体pRI201-rdDw4切下并连接入pRI201-35Aktl中并最终构建构建植物表达载体pRI201-35 SAKTI/rddw4（图1C）。

1.2.2煙草转化及转基因植株鉴定参照农杄菌转化法2，以含3个质粒的工程农杄菌分别对栽培烟草K326进行遗传转化，按照谭颖等2的方法对侵染的叶块进行后续培养提取抗性烟株总基因组并以其为模板，用特异性引物F-201（-GACGGCCAGTGCCAAGCTTG-3）/R-AKT（5'-CCACACATAGAAACTCCTAAAACTCC-3）FAF-rd（5_GGGCCAATAGACATGGACCGACTAC-3R-DWF（5-CCGAGTGTTGTGGCGGTGTAC-3）对抗性植株进行PCR鉴定F-201R-Akt引物扩条件为4℃2min：94C，30s，58C，40s，72C，1min，30个循环：72℃，5min：4℃维持F-Rd/R-Dwf引物扩增条件为：94℃，2min94℃，20s，60℃0s，72℃，1min，28个循环：72℃，5min：4℃维持1.2.3转基因烟草PEG渗透胁迫处理以稳定遗传的T1代转基因烟草和同批繁殖的非转基因烟草（K326）为材料，在16h光照/28℃，8h黑暗/23℃条件下萌发生长，待烟苗长至6～8叶期时，移栽至花盆（盆高18cm，直径15cm，每盆裝培养基质5kg），置于温度为（252）℃，湿度70%，光照为1800x，光周期为16h光照/8h黑暗的人工培养箱中恢复培养5d。

参照张祎等2的方法以20%PEG-6000溶液处理K326及转基因烟苗，分别取PEG-6000处理前（0d）及处理1、3和5d的相同部位（自下向上第4叶）烟叶1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于测定烟叶中的抗氧化酶antioxidant enzymes，AOEs）活性;同时取PEG-6000胁迫处理前（0d）及处理6、12和24h的相同部位（自下向上第5叶）叶片1g，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，用于烟叶中K吸收及BRs合成相关基因表达分析设3个生物学重复1.2.4MDA及H2O2含量测定以PEG-6000处理前（0d）及处理1、3和5d的叶片为材料，参照南京建成生物工程研究所丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法，A003-1-2）及H2O2测定试剂盒（比色法，A064-1-1）方法制备待测样，分别于532和405mm波长下测定吸光值，计算MDA和H2O2含量每组设3個生物学重复1.2.5AOEs活性测定参照南京建成生物工程研究所POD（比色法，A084-3-1）、SOD（WST-1法，A001-3-2）和CAT（可见光法，A007-1-1）酶活力测定试剂盒说明书操作制备待测样，待测样分别在420、550和405m波长下吸光值，计算POD、SOD和CAT酶活力。

每组设3个生物学重复1.2.6K吸收及BR合成相关基因表达分析分别取PEG胁迫处理前（0h）和胁迫6、12和24h的转基因与非转基因烟草相同部位叶片组织0.1g，按照OMEGA Plant RNA Kit试剂盒说明提取总RNA，并按Applied Biosystems，反转录操作将RNA反转录为cDNA使用美国ABI7500实时荧光定量PCR仪检测转基因烟株叶片中K吸收相关基因，如HAK1、AKT1、NP1和TORKI以及BRs合成相关基因（DF4、DET2、CPD和RO73）的相对表达量，以烟草B-Acin作为内参基因（表1），每个样品设3个重复1.2.7数据处理采用SPSS18.0软件进行数据处理，Duncan法分析其差异显著性2结果2.1植物表达载体的构建及酶切验证构建了以CaMV35S启动子驱动N.sylvestrisAKT表达（CaM35：NSAKT）的植物表达载体pRI201-35 SAKTI，以A.haliana rd294基因启动子启动A.thaliana DWF4基因（ATDWF4）表达（r29A：AIDF4）的植物表达载体pRI201-rddwfe4和同时含有上述两个表达元件（CaM/：NSAKT1和r29A：ATDWF4）的植物表达载体pRI201-35SAKTI/Rddwft4。

pR201-35SAkt1经NleI/SaI双酶切可产生2682bp和10432bp两条带（图2A）;pRI201-rdidwf4经Kpn I/NotI双酶切可产生2552bp和10432bp两条带（图2B）pRI201-35SAkt-rddwf4经NdeNotI双酶切后可产生5484bp和10182bp两条带（图2C）说明目标片段已经整合到质粒载体中2.2转基因烟株获得及PCR鉴定分别以含有pRI201-35SAkl、pRI201-rddwf4以及pRI201-35SAKTI-rddwfe4质粒的工程农杆菌对K326叶片进行遗传转化，经一系列培养后获得抗性植株（图3A）剪取抗性烟株叶片0.1g提取总DNA，以特异性引物F-201R-Akt对转pRI201-35SAk载体的烟株进行鉴定，可扩增产生993bp大小的特异性条带（图3B）：以引物F-RdR-Dwf对转pRI201-rddwf载体的烟株进行鉴定，可扩增产生554bp大小的特异性条带（图3C）而共转植株可同时扩增到993bp和54bp两条特异带（图3D）最终，鉴定到单转NSAKT植株56株，单转ADF4植株42株，共转NSAKTIATDWF4植株38株。

2.3PEG胁迫对转基因烟草生长的影响PEG胁迫试验表明，3～5叶期转基因和非转基因（W）植株经PG胁迫3d后，单转ATDWF4植株（Dw）和单转NSAKT7植株（Ak）均出现了不同程度的萎蔫，而共转NSAKTILATDWF4的烟株（AkDw）仅少数叶片出现萎蔫，Wt叶片完全萎蔫、变黄（图4A）：68叶期的转基因烟苗对PG胁迫均表现出一定的抗性，但在胁迫处理10d时，单转植株（Ak和Dw）的萎蔫程度显著高于AkDw植株，而W植株在处理10d时叶片（完展叶和心叶）完全萎蔫，且下部叶片为焦枯色（图4B），说明无论是3～5叶期的小烟苗，还是68叶期的大烟苗，AkDw植株都表现出较强的耐旱性可见共转NSAKTIATDWF4植株耐旱性高于单转AIDF4植株，高于单转NSAKT植株2.4PEG胁迫对不同烟株理化指标的影响2.4。