促红细胞生成素及其受体在星形胶质细胞缺糖缺氧模型中的表达及意义.doc

水通道蛋白4在缺氧缺糖后水肿星形胶质细胞中的作用唐兆华，廖正步，蒋光元，支兴刚，石全红，何朝晖，詹 彦 （400016 庆，重庆医科大学附属第一医院神经外 科）［摘要］目的 探讨水通道蛋白4 （aquaporinl, AQP4）在缺氧缺糖培养后水肿星形胶质细胞中的表达变化与作用 方法星形胶质细胞分为正常组和缺氧缺糖组，缺氧缺糖组细胞经过5 h缺氧缺糖后恢复正常条件培养至0.5、2、8、 24 h和48 h 5个时间点时，用光镜观察细胞形态变化，RT-PCR及免疫荧光法测定AQI）4的mRNA及蛋口的表达变化•结果 ① 在缺氧缺糖后0.5 h,细胞肿胀逐渐形成并继续加重,2 h肿胀达到高峰,至8 h和24 h时肿胀逐渐消退,48 h细胞基 木恢复正常形态②RT-PCR和免疫荧光检测：在缺氧缺糖后0.5 h, AQP4 mRNA和蛋白的表达均较正常组明显下降（/K0. 05） , 2h回升,8 h明显超过正常水平,达最高值（/K0. 05） , 24h有所下降，但仍明显高于正常水平（A0. 05）, 至48 h时mRNA和蛋口的表达均基本恢复正常水平结论5 h缺氧缺糖后星形胶质细胞水肿的过程中，AQP4在水肿形 成期表达降低，可能是抑制其介导的水分进入细胞内；而AQW1在水肿消退期表达升高，可能是促进其介导的细胞内水 分排出。

［关键词］水通道蛋口4;细胞水艸；星形胶质细胞；缺氧缺糖［中图法分类号］ ［文献标志码］AEffect of aquaporin4 on swelling of astrocytes after oxygen-glucose deprivationTang Zhaohua, Liao Zhengbu, Jiang Guangyuan, Zhi Xinggang, Shi Quanhong, He Chaohui, Zhan Yan (Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University^ Chongqing, 400016 China)[Abstract] Objective To explore the effect of aquaporin4 (AQP4) on swelling of astrocytes after oxygen-glucose deprivation(OGD). Methods Astrocytes were observed 0.5, 2, & 24 h and 48 h after 5 h OGD respectively. Microscope was used to investigate morphological alterations of astrocytes. The expression of AQP4 mRNA and protein of astrocytes were detected by RT-PCR and immunofluorescence staining. Results Astrocytes began to swell at 0.5 h, and it aggravated to the peak at 2 h, then swelled cells recovered gradually to normal morphology until 48 h after 5 h OGD. The expression of AQP4 mRNA and protein declined transiently at 0.5 h, and then increased to the peak at 8 h, return to normal level at 48 h after 5 h OGD. Conclusion AQP4 decreased during formative stage of cell swelling, which may inhibit water influx into astrocytes, and increased during recovery stage of cell swelling, which may help swelled astrocytes eject water, after 5 h OGD.[Key words] aquaporin-4;cell edema;astrocyte;oxygen-glucose deprivationSupported by (he National Natural Science Foundation of China (30801182) . Corresponding author: Liao Zhengbu, Tel :86 23 89011150, E mai 1:1 iaozhengbu@hotm

脑水肿主要由 星形胶质细胞的肿胀引起1,星形胶质细胞肿胀的稈 度决定着脑水肿的严重程度水通道蛋白4（aquaporin4, AQP4）在星形胶质细胞胞体和足突中 均大量表达，具有特异的水转运功能目前大量研究 结果表明，AQP4与各类脑水肿的发生或转归密切相关 3,为脑水肿分子机制的研究提供了新的途径但 在脑水肿形成及消退的整个病理过程中，AQP4在水肿 星形胶质细胞中的表达变化和发挥的作用，国内外尚 未进行深入的研究而各型脑水肿发生发展的过程中 均伴有脑细胞不同稈度的缺氧缺血本研究旨在观察 缺氧缺糖麻星形胶质细胞水肿形成及消退的过稈中，AQP4的动态表达变化，并初步探讨AQP4在脑水肿发生 和转归过程中的作用1材料与方法1. 1材料新生2d内的SD大鼠（重庆医科大学实验动物中心提供）， 胎牛血清（美国Gibco）,无糖DMEM培养基（北京钮因华信）, 神经胶质原纤维酸性蛋白（美国Sigma）, RT-PCR试剂盒（美国 Ferments）,羊来源AQP4多克隆抗体（美国Santa Cruz）,兔抗 羊IgG抗体（美国KPL）1. 2星形胶质细胞原代培养及鉴定星形胶质细胞原代培养参照文献⑹，并加以适当的改进。

取新生2d内SD大鼠大脑皮层，剪碎并通过200冃网筛，0.25% 胰酶和0. 025% EDTA消化10 min,加含10%胎牛血清DMEM/F12 培养基（正常培养基）和D-IIANKS液，离心，去上清液，加正 常培养基吹打并接种到有多聚赖氨酸涂底的培养瓶，于 37 C, 20% 0：” 5% C0?的孵箱1 h,将细胞悬液换至另一培养 瓶,隔2〜3d换液1次,7d后37 C, 200 r/min水平振荡18 h, 换液，细胞长满至90%-95%瓶底后传代,至第3代时得到成熟 纯化的原代星形胶质细胞，用神经胶质原纤维酸性蛋白进行 细胞免疫荧光鉴定1. 3实验分组及缺氧缺糖模型的建立将成熟纯化的原代星形胶质细胞分为：①正常组：②缺 氧缺糖组：将星形胶质细胞行缺氧缺糖培养缺氧缺糖模型的制作叫去掉星形胶质细胞的培养基，用 PBS冲洗2次,换为不含血清的无糖DMEM培养基,置于1% 0“ 5% C0：’的孵箱（美国Thermo）缺氧培养5 h时再换冋正常培养 基，并于20% 02, 5% C0,的孵箱常氧培养至0. 5、2、8、24 h 和48 h 5个时间点预实验中，缺氧缺糖有2、5 h和8 h 3种 时长，其中仅5 h缺氧缺糖的损伤能引起星形胶质细胞明显水 肿。

1.4星形胶质细胞形态及超微结构观察用倒置显微镜（徳国Leica） 接观察5 h缺氧缺糖后各时间点星形胶质细胞的形态变化1. 5 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR ）检测AQP4 mRNA 的表达按Trizol试剂说明提取细胞总R\：A,采用MMLV逆转录试剂 盒按操作说明逆转录为cDNA,产:物进行PCRAQP4引物：上游: 5 -CCTACAGAACCAAGGCGTAA-3,下游：5 -TCCCTGGAAATGACTGAGAA-3J ,扩增片段261 bp； 肌动蛋 白引物:上游：5 -ACCTCCAACACCCCAGCCATG-3,,下游：5 -CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3* ,扩增片段691bpo 反应体 系25叮，PCR扩增条件：94 C预变性5 min； 91 V变性30 s, 58 C退火45 s, 72 C延伸1 min,共循环30次，最后72 C 再延伸10 minq PCR产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,长波 紫外灯下观测照相，电泳结果以Quantity One （美MB io-Rad） 图像分析系统进行电泳条带光密度分析，计算AQP4与B-肌动 蛋白产物的光密度积分比值,作为AQP4 mRNA的表达水平（引 物合成山上海生工提供）。

1.6免疫荧光染色检测AQP4蛋白的表达将细胞爬片，用4%多聚甲醛固定15 min： PBS清洗3X5 min, Triton X-100处理5 min； PBS清洗,封闭用兔血清37 C 封闭30 min；加入羊来源AQP4多克隆抗体（1 : 50）37 C孵育1 h, 4 C冰箱过夜；PBS清洗,加FITC标记的兔抗羊IgG （1 : 100）及DAP 1（1 : 800）, 37 C孵育1 h； PBS,甘油缓冲液封 片使用正置荧光显微镜（徳国Leica）观察每一样木随机 取3个视野的细胞用Image-Pro plus软件对荧光图像进行分 析，得到的免疫反应产物平均光密度值作为AQM蛋fl的表达 水平1.7统计学分析计量资料以无土 s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行组 间比较的单因索方差分析2结果2. 1星型胶质细胞的原代培养及鉴定原代成熟的星形胶质细胞WGEAP荧光染色鉴定，细胞纯 度＞98% （图1）倒置显微镜下观察:原代成熟的星形胶质细 胞成片生长，呈多边不规则形，有细长突起，细胞间连接紧 密（图2A）图1 GAFP细胞免疫荧光染色观察原代成熟星形胶质细胸（荧光显微镜x400）2.2缺氧缺糖培养后星形胶质细胞的形态变化倒置显微镜下：预实验中3 h缺氧缺糖后星形胶质细胞形 态未见明显变化；8 h缺氧缺糖后人量星形胶质细胞己出现凝 固性坏死。

星形胶质细胞经5 h缺氧缺糖后0.5 h时开始出现 边缘皱缩,轮廓加强，胞体略增大,细胞质内出现较多颗粒 样物质，2 h时形态变化加重,细胞明显肿胀变圆,折光率明 显增高,突起增粗缩短,有细胞间紧密连接断裂,少量细胞 呈凝固性坏死，8 h时细胞形态变化育所减轻，肿胀的细胞稍 缓解,部分坏死细胞己脱落悬浮,细胞数量减少,24 h时肿 胀虽继续缓解，但较正常细胞仍有明显肿胀，至48 h时，细 胞基木恢复扁平，多边形，有细长突起的正常形态（图2B〜巧A：正常组；B~F：分别为缺氧缺糖组0.5、2、8、24 h和48 h图2星形胶质细胞5 h缺氣缺（I后的形态观察（倒置显微镜X200）2. 3 RT-PCR检测缺氧缺糖后AQP4 mRNA的表达变化与正常组（0. 78+0. 05）相比，星形胶质细胞AQP4 mRNA 在5 h缺氧缺糖后0.5 h时表达先下降［（0. 47+0. 04）, P<0.05］, 2 h时开始回升［(0. 73 + 0. 0。