04牛肉膏蛋白胨培养基的制备.doc

第四次课：牛肉膏蛋白月东培养基的制备（2学时）一、 实验原理我们知道，在实验室中培养微生物要用培养基培养基是根据微生物的营养 需要，按比例人工配制而成的营养物质培养基的种类很多，按状态分，可分为个体培养基、液体培养基和半固体培 养基多数微生物在中性偏碱的培养基中生长良好，少数在酸性中生长良好因 此，配置的培养基在灭菌前必须调节好PH值我们木次实验要做的是牛肉膏蛋白豚培养基牛肉膏蛋白豚培养基是一种应 用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基 中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基木的营养物质，所以可供作微生物生长繁 殖之用普通培养基含有牛肉膏、蛋白腺和NaCL其中牛肉膏为微生物提供碳源、 能源、磷酸盐和维生素，蛋白月东主要提供氮源和维生素，而NaCI提供无机盐 在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96C时溶 化，实际应用时，一•般在沸水浴中或下血垫以石棉网点沸溶化，以免琼脂烧焦 琼脂在4CTC时凝固，通常不被微生物分解利用固体培养基中琼脂的含量根据琼 脂的质量和气温的不同而有所不同由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或 微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

牛肉膏蛋白豚培养基的配方如下：牛肉膏 1.5g蛋白月东 5.0gNaCI 2.5 g水 500mlpH 7.4 〜7.6二、 目的要求1. 了解培养基的配置原理2. 掌握配置培养基的一般方法步骤3. 掌握高压灭菌技术三、 实验步骤1 •称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋H腺、NaCI放入烧杯中牛肉 膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面川I•中称量，用热水溶化示倒入烧杯也可放 在称量纸上，称量后岚接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离, 然后立即取出纸片蛋白腺很易吸湿，在称取时动作要迅速另外，称药品时严防药品混杂，一 把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品2. 溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然麻，在石棉网上加 热使其溶解将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制同体培养基 时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分，在 制备川三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于二角瓶 中，然后按1.5%—2.0%的量将琼脂宜接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化， 而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。

在琼脂溶化过稈中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器同时，需 不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦，配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免 离了进入培养基中，彩响细菌生长3. 调 pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管 向培养基中逐滴加入1 mol/L NaOH边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直 至pH达7.6反Z,用1 mol/L HC1进行调节对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行pH不要 调过头，以避免冋调而影响培养基内各离了的浓度配制pH低的琼脂培养基时, 若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固因此，应将培养 基的成分和琼脂分开火菌后再混合，或在中性pH条件下火菌再调整pH4. 过滤趁热川滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察一般无特殊要求的 情况下，这一步可以省去（木实验不需过滤）5. 分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内1） 液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜分装三角瓶的量则根 据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则 根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他 无菌成分，如抗生索等，则装量一定要准确。

2） 固体分装（本实验是）分装试管，其装量不超过管高的1/5,灭菌后 制成斜面分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜3） 半固体分装 试管一般以试管高度的1/3为宜，灭繭后垂育待凝分装过稈中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污 染6 .加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试 管帽等），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能7.包扎加塞后，将全部试管用皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时 冷凝水润湿棉塞，其外再用一道皮筋扎好用记号笔注明培养基名称、组别、配 制口期三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用皮筋扎好，同样用记号笔注明培养基 名称、组别、配制日期灭菌灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽抱（或抱了） 消毒和火菌有些不同，它是用物理、化学因素杀死致病微生物或杀死全部微久物 的营养细胞及一部分芽砲A. 灭菌方法灭菌方法很多,有过滤除菌法；化学药品消毒和灭菌法,利用 酚、含汞药物及甲醛等使细菌蛋白质凝固变性以达灭菌目的；还有利用物理因素, 例如高温、紫外线和超声波等灭菌的加热灭菌是最主要的，加热灭菌法有两种: 干热灭菌和高压蒸气灭菌。

高压蒸气灭菌比干热灭菌优越，因为湿热的穿透力和 热传导都比干热的强，湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白很易凝固变性，所 以湿热灭菌效果好湿热灭菌的温度一般是在12FC,灭菌15〜30 min；而干热 灭菌的温度则是160X?,灭菌2h,才能达到湿热灭菌121C的同样效果1） 干热灭菌法：培养皿、移液管及其他玻璃器1111可用干热灭菌先将已包 装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160C后维持2h,把恒温箱的调节旋 扭调回零处，待温度降到50C左右，才可将物品収出请注意：灭菌时温度不得超过170C,以免包装纸烧焦灭菌好的器1111应保 存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌2） 高压蒸气灭菌法：该法使用高压灭菌锅，微生物实验所需的一切器血、 器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌高压熬气火菌锅是能耐一定压力的密闭金属锅，有立式和卧式两种灭菌锅 上附有压力表、排气阀、安全阀、加水口、排水口等卧式灭菌锅还附有温度计 有的还有蒸气入口灭菌锅的加热源有电、煤气和蒸气三种B. 灭菌锅（我们所用仪器为自动仪器，温度压力出厂时已经设定好）的操 作过稈：（1） 加水：首先关闭排气排水阀门，然后由加水口加入水至止水线处。

关闭 进水阀门2） 装锅：把需灭菌的器物放入锅内（注意：器物不要装得太满，否则灭菌 不彻底），关严锅盖（对角式均匀拧紧螺旋），打开排气阀1）点火：启动电源开关待第一次排气开始计时4） 中断热源：达到火菌时间要求后停止加热，任其H然降压，当指针回到 0时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温 度没下降面使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又玷污了棉塞）5） 揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水6） 待培养基冷却后置于37C恒温箱内培养24 h,若无菌生长则放入冰箱 或阴凉处保存备用9. 搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至5（rc左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端 搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为10. 无菌检杳将灭菌培养基放入37C的温室中培养24~48h,以检杳灭菌是否彻底五、实验报告1培养基配制好以后，为何必须立即火菌？如何检验火菌情况？2配制培养基过稈中要注意什么问题？为什么？。